全局轉錄調控在細胞工廠構建中的應用與進展

周子康，許平

（1 上海交通大學生命科學技術學院，上海200240；2 上海交通大學微生物代謝國家重點實驗室，上海200240）

許多原核和真核細胞系統是生產高附加值化合物、天然產物和生物能源的最佳宿主。經典的代謝工程方法非常適合于改善通路通量和提高產品產量。但是，這種方法在改變復雜細胞表型的能力上非常有限。復雜表型包括生長速率、生物轉化率和耐受性，而全局轉錄調控工程（global transcription machinery engineering,gTME）是改變復雜細胞表型的通用方法。這種方法主要是引入通用轉錄相關蛋白的突變，引發基因網絡和細胞代謝的重編程。通過將突變蛋白表達與表型選擇和篩選聯系起來，從而篩選出引發新的復雜細胞表型的突變體。但是，由于很難從頭預測突變蛋白序列與功能之間的聯系，因此通常通過創建轉錄因子的突變文庫并選擇可改善所需表型的突變庫來簡化該方法。gTME 已成功應用于原核和真核系統，提高了微生物的環境耐受性、代謝產物的產量和底物的利用率，包括乙醇耐受性[1-2]、番茄紅素產量的提升[2]和木糖發酵過程的優化[3]。因此，gTME 是基于轉錄水平菌株開發的有效工具，可以單獨使用或與其他代謝工程技術結合使用，構建更高效的細胞工廠。

1 全局轉錄調控及其原理

細胞生長過程中有著嚴格的調控機制，可通過對轉錄元件的精準調控，實現細胞中各個基因的時序性轉錄。細胞代謝途徑的復雜性決定了基因與表型之間并非簡單的線性對應關系。某些特定的表型通常由多個基因控制。傳統的代謝工程方法主要針對單一基因進行修飾，但由于代謝途徑的高度復雜性，導致代謝工程的表型往往不能符合預期要求[4-5]。因而，只有同時對多個控制基因同時進行修飾才能得到目標表型。人們對轉錄水平和細胞表型之間關系的深入認識，使得直接操控轉錄組獲得目的表型成為可能，通過細胞轉錄水平的調控，改進細胞的某些代謝性能[1-2,6-8]。

全局轉錄調控工程利用易錯PCR、定點突變等技術對細胞中的轉錄因子或其他轉錄元件進行定向或非定向的突變修飾，調節RNA 聚合酶對啟動子的結合能力，改變細胞轉錄效率，使得基因的表達在轉錄水平發生整體改變。整體轉錄水平的變化可以引發多基因控制的細胞表型，通過不斷篩選可以實現復雜表型的定向進化。此外，基因上游調控區域也能影響細胞的轉錄水平。這些調控區域可與特定蛋白結合，實現下游轉錄的“激活”或“抑制”，形成“+”或“-”的調控途徑，由不同的調控途徑聯結成復雜的調控網絡，共同控制細胞內的各種代謝過程。Martínez-Antonio[9]和Richard等[10]分別研究了大腸桿菌和釀酒酵母中的轉錄調控網絡，證實原核和真核細胞的功能與轉錄調控網絡高度相關，多層次的轉錄調控網絡和全局轉錄因子調控著其他轉錄元件，實現細胞內部轉錄過程的精準調控。轉錄組水平的多樣性賦予了細胞不同的表型[3,11-13]。相比紫外誘變、定點突變等方法，全局轉錄調控效率更高，可以引發代謝途徑上多個基因轉錄的同時微調，實現對復雜代謝途徑的快速優化，從而高效獲得目的表型。

2 全局轉錄調控在代謝工程中的應用

2.1 gTME在原核生物中的應用

gTME 可以同時上調或下調數百個基因，尤其是那些涉及DNA 識別的成分，如全局轉錄因子和RNA 聚合酶亞基。 將來自耐輻射球菌（Deinococcus radiodurans）的全局調控因子IrrE 引入大腸桿菌，以增強其對乙醇、丁醇和乙酸鹽脅迫的抗性[14]。同樣，來自密蘇里游動放線菌（Actinoplanes missouriensis）、 橙 黃 小 單 孢 藻（Micromonospora aurantiaca） 和 沙 里 氏 單 胞 菌（Salinispora arenicola）的外源西格瑪因子σHrdB，被引入游動放線菌中，用于隨機誘變/DNA 改組，成功地提高了游動放線菌中替考拉寧（太古霉素）的產量。據報道，最佳突變菌株可產生5.3mg/mL 替考拉寧，產量是原始菌株的2 倍[15]；Alper 等[2]發現gTME 在番茄紅素的生物合成過程中效果顯著。他們從4 種大腸桿菌中分離出各自的σ70因子，對各自編碼σ70因子的rpoD 進行多輪隨機突變，再將突變后的rpoD 分別回補，測定含有突變σ70因子的菌株中番茄紅素的產量。其中一株突變菌株中的番茄紅素含量達到了7.7mg/L，比野生型大腸桿菌的4.2mg/L 的番茄紅素含量提高了將近一倍。于慧敏等[16]利用gTME 的方法，以大腸桿菌為宿主，通過對大腸桿菌細胞的RNA 聚合酶中編碼σ 因子的rpoD和rpoS進行隨機突變，建立突變文庫，通過高通量方法篩選高產透明質酸的突變株。其中突變rpoD 篩選獲得的菌株D72 透明質酸的產量達到561.4mg/L，透明質酸的細胞干重達到了265mg/g。

2.2 gTME在真核生物中的應用

相比原核細胞中的唯一的四亞基組分RNA 聚合酶，真核生物有三種RNA 聚合酶，聚合酶Ⅰ存在于核仁，聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ存在于核質。聚合酶I 合成除5S 以外的rRNA，聚合酶Ⅱ主要是RNA聚合酶，聚合酶Ⅲ合成tRNA 和5S rRNA。另外，真核生物轉錄需大量轉錄因子，它們按順序結合到聚合酶上共同完成轉錄[17]。正是這種復雜性，為gTME 技術在真核細胞中的應用提供更多的突變靶標。Alper 等[1]通過易錯PCR 對釀酒酵母RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子TFIID 中TAF25 亞基和與TATA 序列結合的SPTl5亞基進行多輪突變，篩選出對高濃度葡萄糖和乙醇耐受的酵母菌株；Cao 等[18]在釀酒酵母中引入TPS1（6-磷酸-海藻糖合酶）可以使釀酒酵母在18%（體積分數）乙醇中的存活率更高，最終乙醇生產濃度提高約15%；Jung 等[19]通過抑制ATH1（酸性海藻糖酶）的表達促進了酵母在8%（體積分數）乙醇條件下的生長，并使乙醇生產率提高了約100%。Qiu等[20]利用易錯PCR對釀酒酵母的RNAP Ⅱ的Rpb7 亞基進行突變，篩選乙醇高耐受性和高產突變株，結果發現，突變株的乙醇產量約為122g/L（理論產率的96.58%），比對照組增加了40%。同時，DNA 微陣列分析表明，發酵12h后，突變株中有369個基因存在表達差異，涉及糖酵解、酒精發酵、氧化應激反應等。由此可見，全局轉錄工程著眼于直接調控細胞整體基因轉錄水平，指向性強，方法簡便。對所得到的突變體進行分子機制的解析可為進一步定向改造提供關鍵的研究目標。

3 全局轉錄調控提升菌株耐受性

隨著gTME 方法的發展，已有許多通過gTME技術提高菌株耐受性的報道。Alper等[2]在大腸桿菌中通過篩選突變的全局轉錄調控因子σ70，不僅提高了番茄紅素的產量，同時使得突變株能夠雙重耐受60g/L乙醇和高濃度的SDS；Klein-Marcuschamer等[21]應用gTME 技術對植物乳桿菌的σ 因子進行改造，發現僅將σ因子中345位的Gln替換成Lys就可以顯著提高植物乳桿菌對乳酸和高濃度鹽的雙重耐受性；Gao等[22]隨機突變大腸桿菌σD因子，從突變文庫中篩選出的耐酸突變體在pH 3.17 條件下生長速率是野生型的1.5 倍；Matsui 等[23]對釀酒酵母的轉錄調控因子PDR1進行單點突變，成功篩選出有機溶劑耐受的菌株。突變株能在異辛烷/YPD 兩相系統中將3-氧代丁酸丁酯還原成3-羥基丁酸丁酯；Basak 等[24]將甲苯作為選擇壓力，利用易錯PCR 將大腸桿菌的全局調控因子CRP 進行隨機突變和建庫篩選，在誘變文庫中篩選到了一株能夠耐受0.23%甲苯的突變體，而這個甲苯濃度下的野生型菌株的生長被完全抑制。進一步的研究表明，改造CRP可以明顯改善大腸桿菌在氧化應激條件下的耐受性，通過高通量篩選得到了耐受突變株OM3，該菌株能夠在12mmol/L H2O2條件下生長，而野生型的生長則被完全抑制。Zhou等[25]在大腸桿菌中表達全局轉錄調控因子IrrE顯著促進了酸性條件下惡臭假單胞菌的生長和提高了尼古丁的降解效率。可以預見，gTME 在工業微生物的育種中將得到更廣泛的應用。

4 結語

代謝工程學的出現旨在改善細胞特性，以生產有用的化學藥品并用于更廣泛的生產生活應用場景中。進一步的細胞改良和多基因表型的調控需要同時精準控制多個基因的表達。全局轉錄調控概念的出現，適時地擴展了代謝工程的應用范圍。gTME可以通過修飾負責協調轉錄的關鍵轉錄因子介導整個轉錄組水平的調控，從而控制生物合成途徑中關鍵酶的表達水平，最終確定代謝網絡的方向、通量和平衡[26]。這種方法已經在細胞工程、代謝工程應用實例中取得了成功，使其目標化合物的產量、宿主細胞耐受性等有了顯著的提高和改善。細胞全局轉錄調控工程的研究表明，細胞代謝網絡具有很大的彈性，可通過多種手段對代謝通量進行優化，對代謝網絡進行重編程，從而獲得性能優良的工業微生物菌種。gTME 結合生物信息學相關技術，將使人們獲得更多的基因與表型之間的關系信息，為更快速改造細胞的代謝和生理功能提供新的方向。