蛋白聚糖調控間充質干細胞成骨分化的研究進展

吳靖漪 陳嘉文 孫天語 劉鵬 吳補領

南方醫科大學口腔醫院1種植中心，4牙周科（廣州510280）；2南方醫科大學南方醫院口腔科（廣州510515）；3南方醫科大學口腔醫學院（廣州510515）；5南方醫科大學珠江醫院口腔科（廣州510282）；6南方醫科大學深圳口腔醫院（坪山）（廣東深圳518118）

間充質干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）具有多向分化潛力，由于其來源廣泛并可以在體外大量擴增，是骨組織再生工程中熱門的種子細胞，并在臨床試驗中獲得了顯著的修復效果［1-2］。先前研究主要集中在多種信號分子對干細胞穩態的調控［3］，然而干細胞微環境亦是干細胞成骨分化的關鍵影響因素。蛋白聚糖（proteoglycans，PGs）是構成MSCs 微環境的最主要成分之一［4］，參與調控其自我更新與譜系分化之間的動態平衡。既往研究認為蛋白聚糖具有組織特異性，能夠參與配體、趨化因子、生長因子等在細胞外的梯度擴散。近年來研究還表明蛋白聚糖能與細胞外信號分子結合共同調控信號通路的傳導，從而影響干細胞自我更新和成骨分化之間的動態平衡［5-6］。深入揭示蛋白聚糖在干細胞成骨分化中的調控機制，能夠為干細胞在骨修復應用中的臨床轉化提供理論依據。本文將重點闡述蛋白聚糖調控不同間充質干細胞成骨分化的作用、潛在機制及其臨床應用。

1 蛋白聚糖的結構組成及功能特點

蛋白聚糖是由一個或多個GAGs 通過絲氨酸殘基以共價鍵形式結合在一個核心蛋白上組合而成的多糖大分子，是細胞膜及細胞外基質的重要構成成分，與細胞的結構和功能緊密相關。

蛋白聚糖的生物學功能主要來源于其結構中多樣的GAGs 鏈。GAGs 是由二糖單位重復連接形成的高硫化線性多糖，主要分為硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）、硫酸軟骨素（chondroitin sul?fate，CS）、硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS）、硫酸角質素（keratan sulphate，KS）、透明質酸（hyaluron?ic acid，HA）和肝素（heparin，HEP）［6］。不同的GAGs 之間主鏈差異較小，但經進一步硫酸化、脫乙酰基和異構化修飾后，GAGs 長鏈間出現明顯生物構象及功能差異。GAGs 屬于翻譯后修飾產物，其合成無確定的模板，組織器官來源及個體化差異等均會影響其硫酸化修飾，各異的硫酸化修飾的位點和硫化程度使GAGs 具有豐富的結構域，能夠為不同的信號蛋白、生長因子及趨化因子等提供結合位點［7-8］，以此賦予蛋白聚糖不同的生物學功能。GAGs 的表達具有明顯的時空特異性，它通過不斷調整自身糖鏈結構，以在不同時期適應與特定生長因子的結合，協助其擴散或與其受體競爭性結合這些生長因子，從而雙向調控信號通路傳導。此外，GAGs 與特定生長因子具有高親和力，可以結合并保護這些生長因子免受蛋白酶降解，進而維持穩定的信號分子濃度梯度。

由此可見，多樣的GAGs 與其所依附的核心蛋白決定著蛋白聚糖將以多種方式廣泛參與細胞的生物學活動［9］。蛋白聚糖持續參與重塑動態變化的細胞微環境，影響干細胞及子代細胞的增殖與分化［6］，廣泛參與調控胚胎發育［10］、細胞分化［11］、組織再生［12］以及腫瘤進展［13］等多個生物學環節。

2 蛋白聚糖在干細胞成骨分化中的作用

蛋白聚糖與骨組織發育再生密切相關，大量研究已觀察到核心蛋白聚糖（decorin）、雙鏈蛋白聚糖（biglycan）、基底膜聚糖（perlecan）和聚集蛋白聚糖（aggrecan）等多種蛋白聚糖在骨組織發育的不同時期廣泛表達，這些蛋白聚糖參與構成骨基質的形成和礦化，在骨組織發育及修復中起著必不可少的作用。FAM20B 調控著蛋白聚糖上的GAGs 與核心蛋白之間鏈接區內木糖（xylose）的磷酸化，是GAGs 連接于蛋白聚糖發揮正常生物學功能的必要激酶。LIU 等［10］在神經嵴來源的間充質細胞內特異性敲除Fam20B 基因，導致GAGs 無法與核心蛋白順利連接，構建了GAGs 缺失小鼠模型，觀察到小鼠顱面部骨骼發育明顯異常，表現為骨質礦化不足，顱縫較正常小鼠顯著增寬。說明蛋白聚糖對骨骼系統的正常發育起著關鍵的調控作用。

蛋白聚糖在骨組織中的作用不僅在動物體內觀察到，參與編碼多種蛋白聚糖的基因突變亦會導致遺傳性骨發育疾病。Schwartz?Jampel 綜合征的致病基因是編碼Perlecan 的基因突變，突變患者分泌到細胞外基質內的Perlecan 顯著減少，阻礙生長板的正常形成，并引起軟骨細胞聚集障礙，導致嚴重的軟骨發育不全及骨組織的結構異常［14］。

骨骼系統的正常發育不僅依賴于蛋白聚糖的完整功能，蛋白聚糖正常的硫酸化修飾對于骨組織發育亦起著不可或缺的調控作用。SLC26A2 是胞膜上的硫酸鹽轉運體，可為蛋白聚糖的硫酸化修飾提供充足的硫酸鹽，其功能缺失導致軟骨細胞及成骨細胞的硫酸鹽攝取顯著下降，軟骨內的蛋白聚糖硫化程度嚴重降低，生長板內的Ihh 信號通路的活性降低，抑制軟骨細胞增殖，推遲次級骨化中心的形成，最終造成多種遺傳性骨發育疾病的發生，包括骨畸形性發育不良、軟骨成長不全以及多發性骨骺發育不良［15］。由此可見，蛋白聚糖廣泛參與了骨和軟骨發育形成的全過程，其完整的結構和功能時刻影響著復雜的骨組織發育調控網絡，是骨骼系統發育生長調控的關鍵分子。

2.1 蛋白聚糖在調控骨髓間充質干細胞分化中的作用間充質干細胞自我更新和成骨分化之間的穩態是目前研究的重點之一，其精準調控需要多個信號分子有序的時空表達。目前的觀點認為GAGs 是干細胞轉向分化狀態中必需的信號調控分子。敲除小鼠ESCs 中編碼HS 鏈合成的Ext?1 基因后，干細胞的分化活動明顯受阻［16］。蛋白聚糖作為該動態平衡中重要的信號分子，它的種類及分布具有明顯的組織特異性。隨著MSCs 進行成骨分化，蛋白聚糖的表達模式也不斷地發生著變化，CSPG 和DSPG 的含量逐漸降低，相反的HSPG含量逐漸上升［17］。與蛋白聚糖中的核心蛋白相比，其上共價連接的GAGs 是影響MSCs 成骨分化的關鍵。在MSCs 成骨向分化時，合成HS、CS、DS所需的關鍵酶XT?Ⅰ、EXTL2、GalNAcT 及硫化酶HS6ST3 的表達顯著上調［18-19］。由此可見，GAGs 及其硫酸化修飾緊密調控著MSCs 的成骨向分化。體外研究亦表明加入外源性GAGs 能有效增強MSCs的成骨分化潛力，成骨分化的相關基因例如骨鈣素、骨粘連蛋白和Ⅰ型膠原等表達顯著上調［20］，加速骨缺損的愈合［21］。

2.2 蛋白聚糖在調控牙源性間充質干細胞成骨分化中的作用除了調控間充質干細胞成骨分化，多種蛋白聚糖如基膜蛋白聚糖（lumican）、多能蛋白聚糖（versican）、骨調蛋白（osteomodulin，OMD）、Asporin 及外源性的HEP 在牙源性干細胞中的成骨作用也是近年研究的熱點。研究者們在牙髓組織中觀察到基膜蛋白聚糖、多能蛋白聚糖等多種蛋白聚糖的表達，可能密切調控牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的增殖和分化［11，22］。JIANG 等［23］通過在體外牙胚培養中添加化學分子Xyl?MU，抑制GAGs 與核心蛋白的連接，觀察到成牙本質細胞的成骨向分化嚴重受阻，成骨向分化標志物DMP1、DSPP 的表達僅為對照組的20%，基質沉積和礦化亦顯著減少，前牙本質的厚度僅為對照組的二分之一。提示蛋白聚糖的結構和功能完整性對于DPSCs 的成骨分化必不可缺，而蛋白聚糖作為成骨分化中重要的調控分子，它的種類及分布具有明顯的組織特異性。OMD 是一種僅存在于礦化組織內的蛋白聚糖，其C 端結構域對羥基磷灰石有著高親和力。在hDPSCs 的成骨分化后期OMD 的表達顯著上調35 倍，研究者們進一步通過shRNA 沉默OMD 的表達后，shOMD?hDPSCs組的成骨標志物表達水平僅為對照組的三分之一，并且無法形成礦化結節［11］。由此可見蛋白聚糖不僅參與了hDPSCs 的成骨向分化，亦是基質礦化的重要調控分子。

同樣，外源性的HEP 具有促進hDPSCs 成骨向分化的潛力，可顯著上調成骨標志物BMP?2、ALP、OC 的轉錄水平，促進礦化結節的形成。HEP 良好的組織相容性和成骨潛力使其有望成為直接蓋髓術的新材料［24］。目前關于蛋白聚糖在牙源性干細胞成骨向分化中的調控作用的探討仍處于初級階段，深入闡明蛋白聚糖對牙源性干細胞的成骨調控作用將有助于推動引導骨組織再生、材料學等領域的發展。

2.3 蛋白聚糖調控間充質干細胞成骨分化的作用機制骨形成是長期的動態過程，多條通路的相互作用和精準的時空表達是骨發育再生中必不可少的。蛋白聚糖上的多種GAGs 鏈（如HS、CS）廣泛參與間充質干細胞成骨分化所涉及的信號傳導。FUKUNISHI 等［25］發現MC3T3?E1 細胞在成骨分化過程中所表達的GAGs 對FGF2 以及骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）?2 的親和力顯著上升，有助于GAGs 結合并穩定這些生長因子，從而穩定地調控成骨相關信號通路的傳導。

HS 亦能夠促進BMP?2 和其受體的結合，同時降低頭蛋白（Noggin）對該通路的拮抗作用，促進pSMAD 的激活，從而促進成骨［26］。HEP 可與Wnt3a相互作用，進而激活肌醇磷脂?3?激酶（phosphati?dylinositol?3?kinases，PI3K）/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶（protein?serine?threonine kinase，AKT）信 號通路，并且通過Runt 相關轉錄因子2（runt?related transcription factor 2，RUNX2）促進ALP 的活性，從而發揮促進成骨向分化的作用［27］。除此之外，HEP 亦可正向調節BMP 信號通路活性，同時下調Wnt 通路抑制物Dickkopf1（DKK1）和骨硬化蛋白（Sclerostin，SOST）的表達從而促進hMSCs 的成骨分化。

CS 是構成骨基質最主要的GAGs 之一，其表達水平隨著MSCs 的成骨分化明顯上調，其中高硫酸化的硫酸軟骨素?E（Chondroitin sulphate E，CS?E）的表達水平顯著上升，CS?E 能夠與BMP4 作用促進細胞成骨分化和基質礦化［28］。研究還發現CS?E亦可與上皮型鈣黏蛋白（E?cadherin）、神經型鈣黏蛋白?11（cadherin?11）結合，降低ERK1/2 的磷酸化，激活SMAD3 和SMAD1/5/8，促進成骨分化［29］。

近年來，有學者提出不同結構的GAGs 能夠影響細胞內外的信號傳導。HA 是結構最簡單的GAGs，不經過硫化以游離或非共價復合體形式參與信號傳導調控細胞的生物學活動。ZHAO 等［30］在兔MSCs的體外培養發現，高分子量HA能有效促進兔MSCs 的成骨分化，同時MSCs 形成的鈣結節量隨HA的分子量升高而增多。雖然其具體作用機制尚不明確，但研究者認為可能與HA 改變BMP 通路傳導有關，HA 通過下調BMP?2 的拮抗Noggin 和卵泡抑素（Follistatin）的表達，增強BMP 通路活性從而促進MSCs 的成骨分化能力［31］。但KANEKO等［32］發現高分子量HA 在低濃度下能夠通過與CD44 結合抑制BMP?2 誘導的成骨分化，并下調SMAD1/5/8 的磷酸化水平，提示HA 的分子量與濃度可能存在交互作用。

3 蛋白聚糖在骨組織工程中的應用

蛋白聚糖作為天然的細胞外基質成分，具有良好的生物相容性、可降解性、無免疫原性等特點，是目前骨組織工程材料的研究熱點。通過對蛋白聚糖、GAGs 與多種材料進行修飾及交聯，能夠顯著提高材料的性能，并且將材料制備成便于使用的各種形式。

將GAGs 與合適的生物材料進行復合，模擬骨組織天然細胞外基質結構，從而進一步提高其促成骨作用是目前研究的一大熱點。大量研究將CS、HS、HA 等與膠原蛋白、殼聚糖、鈦板等材料進行復合，制成復合支架、水凝膠等形式的材料，在動物實驗中均表現出優越的促成骨作用［21，33］。在一項前瞻性臨床研究中，LORENZ 等［33］將HA 和β?磷酸三鈣混合制成可注射的骨替代物，該材料不僅具有足夠的機械強度，還具有良好的骨引導能力，可以用于促進患者拔牙窩的骨再生，為后期的種植手術提供有利的骨量基礎，該研究納入21 例患者，行牙拔除術后均在拔牙窩內注射該新型骨替代物。在4 個月的愈合期后，形態學和骨計量學檢查表面發現所有患者的牙槽窩內均有大量新骨形成，且后續種植體的一年存活率達到100%。水凝膠型HA/β?磷酸三鈣骨替代物能夠明顯減少愈合初期結締組織的長入，其多孔結構更是為成骨細胞的長入和后續骨基質的生成沉積提供了良好的機械基礎。HA 在材料中的應用亦能加速內源性成骨細胞的募集并促進成骨作用，極大提升材料的生物學特性。目前，GAGs 已被廣泛運用到骨移植替代材料中，顯著改善了移植材料的生物活性，有效地促進成骨作用，在臨床上具有廣闊的應用前景。

此外，GAGs 可結合并調控生長因子的活性，提高其生物利用度，作為生長因子的替代或補充，解決骨再生中生長因子應用昂貴、釋放不穩定的缺點，為骨組織工程中生長因子的遞送系統提供了更優良的策略，達到更好的促進骨再生效果。CS?GAG 和HS?GAG 作為BMP?2 的載體，均能顯著延長BMP?2 的釋放時間［34-35］。還有研究者合成出與BMP?2 具有高親和力的HS3，添加了HS3 的復合支架能夠顯著維持BMP?2 的生物活性，在27 d 后支架內的BMP?2 含量仍有初始含量的58%，是對照組的三倍，顯著促進了細胞的成骨分化［36］。由此可見，利用GAGs 與生長因子的高親和力，能夠構建生長因子控釋系統的復合支架材料，從而為骨組織工程提供新的思路。

4 結論與展望

目前，利用間充質干細胞介導骨組織再生的研究是生命科學領域的熱點，如何精準調控干細胞穩態，以最大程度發揮其成骨向分化潛能是未來骨組織再生研究的重點。因此，深度揭示干細胞所處微環境對其自我更新和成骨分化動態平衡的影響顯得尤為重要。蛋白聚糖是構成間充質干細胞微環境的主要成分，廣泛存在于真核細胞的細胞外基質中，參與了間充質干細胞成骨向分化的調控。目前臨床研究已發現蛋白聚糖缺陷可導致數種骨組織發育異常的遺傳性疾病，基礎研究也揭示了蛋白聚糖是干細胞穩態調控的重要信號分子，其GAGs 上的硫酸化基團也是參與信號傳導和成骨調控的重要功能域，其潛在的作用機制研究尚處于初級階段，深入揭示明確蛋白聚糖對干細胞成骨分化的調節機制，將有利于在未來對干細胞進行精準的定向化調控，從而促進成骨分化的臨床應用和相關骨缺損的治療。