D-生物素合成研究進展

劉記成，房 歡，董會娜，孫玉梅，張大偉，4

（1.大連工業大學生物工程學院，遼寧大連 116034；2.中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308；3.中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308；4.中國科學院大學，北京 100049）

生物素（biotin）也可稱為維生素B7，主要存在于大自然中的動植物體內，是一種維持人體正常運動所不可或缺的維生素，也是合成維生素C的必要物質。它是含3個不對稱碳原子的雙環化合物，共有8種同分異構體，但只有全順式結構的D-生物素（D-biotin）才具有生理活性[1]。D-生物素的存在形式分為游離狀態與結合狀態，而存在于腸道中結合狀態的D-生物素必須經微生物分解成游離狀態才能被機體利用。最容易被吸收利用的D-生物素存在于動物的小腸中，吸收之后主要分布于心、肝和腎臟中。在豬食料中添加適量D-生物素時，會使豬的肝臟和心臟更有活力，但D-生物素添加過多時，超過自身需要的部分不會被吸收，而是隨著尿液或糞便排出體外[2-3]。

D-生物素最初在酵母的研究過程中被發現，參與酵母中的氮源代謝，因此在白蘭地中添加少量D-生物素可以提高酒的風味[4]，隨著對其深入研究，D-生物素可逐漸應用于畜牧業、生物技術和發酵工業等多個領域。據報道，D-生物素可以促進脂肪迅速分解并轉換成人體運動所需的能量，這一發現奠定了D-生物素在減肥運動類保健品中的應用。自2016年以來，國內外市場上開始暢銷含D-生物素成分的保健品，進而D-生物素的價格也有所上升，這非常有利于我國D-生物素生產企業的發展[5-6]。目前全球D-生物素純品的生產能力達到400 t/年以上，幾乎全部集中于中國，占全球97%以上的市場份額。我國的圣達生物與新和成是全球最大的兩家供應商，據公開資料顯示，目前圣達生物的D-生物素純品年產能為160 t，新和成的D-生物素純品年產能為120 t。近年來，只能通過化學合成法對D-生物素進行工業化生產，但其工藝繁雜、生產成本昂貴和環境污染等問題，使廣大學者開始致力于用微生物合成D-生物素的研究?；谀壳吧锓ê铣蒁-生物素還處于起步階段，該文從D-生物素的生物合成途徑、代謝調控以及生物合成策略等方面進行綜述，以期為D-生物素高產菌株的構建提供參考。

1 D-生物素的化學合成

D-生物素的完整化學合成途徑是Sternbach在1949年提出來的，因而該途徑被命名為Sternbach路線。該路線的原料為富馬酸，經溴代、芐胺化、環合三步反應后合成第一個關鍵中間體環酸；再與醋酸酐反應生成的酸酐經還原和硫代之后，獲得第二個關鍵中間體硫酮；硫酮經格氏反應、氧化、酸化得含硫的鎓鹽，最后經溴代、縮合、酸化得到終產物D-生物素[7]。Sternbach是D-生物素大規模生產的基石，之后的D-生物素工業生產途徑均是以此方法為基準一步步改進的。

1999年陳芬兒等[8]報道了以氯霉素副產物右胺作為手性輔助試劑，右胺與環酸反應后被還原成內酯，進而合成D-生物素，右胺的價格在當時十分廉價，但后來因氯霉素的副作用十分嚴重，這使得右胺越來越不易獲得。2001年CHAVAN S P等[9]報道了一條生產路線，其生產原料為L-胱氨酸，經還原、開環、硫代、強堿下烯醇化后在三甲基硅基的作用下經環化得到D-生物素骨架，最后在wittig反應下獲得終產物，該路線各步反應收率很高，但合成步驟過多，且總產率并沒有顯著提升。2002年SEKI M等[10]報道的生產路線是以L-半胱氨酸為原料，首先經三步反應后在芐基胺和三甲基氰硅烷作用下水解生成酰胺，酰胺經縮合得到硫酮，進而產生D-生物素，該方法簡化了合成路線，但原料不易獲得。以上報道的D-生物素合成路線，或是生產成本較高，或是總收率偏低，均不適合應用于工業生產當中。

2002年我國新昌制藥廠在合成路線上取得重大突破，將國際的11步D-生物素合成法縮減至8步，不僅簡化了工藝流程，還在降低生產成本的基礎上提高了D-生物素的產量，建立了第一條屬于我國自己的化學合成法生產D-生物素路線[11]。2011年和2019年我國浙江新和成藥業分別公開兩種D-生物素合成方法，在2011年公開的方法主要解決了生產原料在和2,2-二氰基乙酸乙酯反應過程中生成副產物的問題，提高了這一步的反應效率，但總收率并沒有顯著提高；在2019年公開的方法是以半胱氨酸鹽酸鹽、苯甲醛和芐基異氰酸酯為起始原料，經9步反應生成D-生物素，該方法生產成本低且產物分離容易，是目前最適合我國工業化生產D-生物素的路線[12-13]。

由以上報道可知，化學法合成D-生物素的途徑已經非常成熟，經過廣大學者們的研究，其生產成本昂貴的問題基本上被解決。但化學法對環境造成污染的問題依舊無法徹底解決，另外其生產工藝流程依舊很復雜，因此加大利用生物法合成D-生物素的研究力度就顯得非常重要。

2 D-生物素的生物合成

2.1 D-生物素的生物合成途徑

大多數微生物都能從頭合成D-生物素，且從前體物質庚二酸單酰載體蛋白（pimeloyl acyl carrier protein，Pim-ACP）或庚二酸單酰輔酶A到D-生物素的途徑是基本一致的。據報道，這部分反應的大體過程為，先由7-酮基-8-氨基壬酸合成酶（BioF）催化L-丙氨酸與庚二酸單酰載體蛋白（Pim-ACP）反應生成7-酮基-8-氨基壬酸（7-keto-8-amino-pelargonic acid，KAFA），隨后7,8-二氨基壬酸合成酶（BioA）將S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethiomnine，SAM）或賴氨酸上的氨基轉移到KAPA上生成7,8-二氨基壬酸（7,8-diamino-pelargonic acid，DAPA），然后脫硫生物素合成酶（BioD）在CO2和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的參與下閉合脲基環DAPA生成脫硫生物素（dethiobiotin，DTB），最后DTB在生物素合成酶（BioB）和其他輔因子的作用下合成D-生物素（圖1）[14-15]。它們的不同之處在于早期合成前體物質：革蘭氏陰性菌在合成前體時，以大腸桿菌為代表，丙二酸單酰ACP在BioC（與D-生物素早期合成有關）作用下ω-羧基發生甲基化生成丙二酸單酰ACP甲酯，隨后經過兩輪脂肪酸延伸循環生成庚二酰單酰ACP甲酯，在BioH（與D-生物素早期合成有關）催化下去甲基生成庚二酸單酰ACP，最后進行D-生物素的合成；而革蘭氏陽性菌，以枯草芽孢桿菌為代表，長鏈酰基ACP在一種細胞色素P450酶BioI催化下生成庚二酸單酰ACP，或者庚二酸在ATP依賴的BioI酶催化下生成庚二酸單酰輔酶A，然后庚二酸單酰ACP或庚二酸單酰輔酶A作為前體生成D-生物素（圖1）[16-17]。近期，SAKAKI K等[18]研究發現Synechocystissp.PCC 6803在缺失了bioA基因的情況下仍然可以產生D-生物素，研究人員對此進行了生物信息分析等一系列實驗，最終發現了一種新型多功能脫氫酶BioU的存在，BioU除了可以代替BioA，還具有BioD的一些功能，并且在整個反應結束后會失去催化活性，這一發現為D-生物素的生物合成提供了一個新的思路。

圖1 D-生物素合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway of D-biotin

2.2 D-生物素生物合成操縱子的調節機制

在動物體內，D-生物素通過將生物素環束縛在蛋白質上的長鏈的幫助下，可在具有酶活的部位上接受羧基，之后釋放給底物受體，進而可以參與體內一系列羧化反應。在原核生物中，生物素連接酶也叫BirA蛋白，在D-生物素生物合成操縱子的轉錄過程中進行負調控。當胞內的D-生物素積累超過一定量的時候，BirA蛋白會與生物素中間體（生物素-5-單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）結合形成配體，之后再與生物素操縱子結合，最終會阻遏生物素操縱子基因的表達；當胞內的D-生物素積累量降低時，酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP）轉移到乙酰輔酶A羧化酶的亞基（AccB受體蛋白）上，BirA蛋白不與生物素-5-AMP結合，進而相關基因開始進行轉錄表達；而當細胞內的乙酰輔酶A羧化酶的另一個亞基-AccC蛋白過量時，AccB與AccC蛋白便會形成一個復合結構體，從而?；d體（ACP）無法與AccB蛋白結合，此時BirA蛋白又與biotinoyl-5-AMP結合成配體，導致其基因的表達被阻遏[19]。解決這個基因表達被阻遏的問題可成為研究者們提高微生物合成D-生物素產量的一種手段。

BirA蛋白在生物素-親和素的研究中也起到十分重要的作用，該研究中的BirA蛋白均來自于原核生物。生物素與親和素/鏈酶親和素有高度的親和性，可形成十分穩定的締合體，是蛋白質-生物小分子體系中結合自由能較強的體系。生物素-親和素/鏈酶親和素體系具有高度的穩定性，在中性條件下的解離常數為10～15 mol/L，遠高于其他的配體-受體作用。兩個體系可以偶聯蛋白質、核酸和酶等活性物質，還能結合固體材料，并且一個蛋白質分子上可以結合多個生物素分子，同時一個親和素也可以結合4個生物素分子，因此生物素-親和素體系還可起到多級放大的作用。生物素-親和素/鏈酶親和素體系的這些作用，使得其在診斷分析和蛋白質工程等方面得到廣泛應用[20]。

2.3 微生物合成D-生物素的研究進展

大多數的微生物都可以用來生產D-生物素，但其原始菌株的生產能力都不高，因此需要根據代謝工程理論，對D-生物素生產菌株通過現代生物技術手段來提高產量。研究者們主要通過對D-生物素生產菌株進行抗性篩選、導入人工改進的生物素操縱子、提高某些輔助因子含量、增強有用的基因以及敲除不利基因等手段來提高微生物合成D-生物素的產量。目前研究的最新成果見表1。

表1 通過代謝控制及基因工程方法構建D-生物素高產菌的研究進展Table 1 Research progress of high yield D-biotin microbes constructed by metabolic control and genetic engineering

2.3.1 代謝控制育種

提高D-生物素產量的首要條件就是篩選優良的微生物菌種，由D-生物素生物合成途徑可知，SAM參與了其中的多個反應，因此通過代謝途徑控制提高發酵過程中SAM的供應量，是獲得高產D-生物素菌株的較好的方法。KANZAKI N等[21]對大腸菌株進行β-羥基正纈氨酸抗性篩選，得到了一株突變體E.coliANA91/pXBRP319，其原理是通過提高細胞體內的甲硫氨酸水平從而增加氨基酸供體的數量，最終增強了工程菌株產D-生物素的能力，其生產能力達970 mg/L，這是目前國內外用大腸桿菌產D-生物素的最高產量。林建平等[22]通過B.subtilis168中bioW基因序列和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ZJU001中S-腺苷-甲硫氨酸合成酶基因（sam2）序列來促進兩段生物素操縱子基因bioBFHCD和bioA對生物素的合成，用E.coliBL21（DE3）為產生菌在以庚二酸為底物的培養基中進行補料發酵，D-生物素產量提高了200倍，達到417 mg/L，這是現階段我國用大腸桿菌產D-生物素的最高產量。達雄星野等[23]對庫特氏菌538-6的酸霉素、5-（2-噻吩基）-戊酸和脫硫生物素抗性進行篩選，得到庫特氏菌屬538-2A13，用FM1培養基發酵，將D-生物素產量由0提高到126 mg/L。SAKURAI N等[24]對粘質沙雷菌進行放線噻唑酸抗性進行篩選，得到了菌株S.marcescensSB412，之后使菌株突變對乙硫氨酸和S-2-氨基乙基半胱氨酸產生抗性，從而獲得菌株ETA 23，再以攜帶parB位點的pLGM304P作為載體來過表達全部bio基因，最后對其進行高密度培養，D-生物素最高可積累到500 mg/L。金學明等[25]從中國普通微生物菌種保藏管理中心購買一株擲孢酵母，經誘變獲得S.cesrosellsHK301，之后在發酵過程中對其進行碳源、氮源以及金屬離子優化，最終D-生物素產量提高一倍，達到540 mg/L。

2.3.2 基因工程育種

基因工程育種可通過在D-生物素代謝途徑中敲除某些對產物有抑制作用的基因或加強有用基因的表達來提高D-生物素的表達量，這是現階段最有發展的一種育種方法。GLOECKLER R等[26]從B.sphaericusIFO3525菌株中擴增出生物素操縱子bioXWF基因，構建出PTG3405質粒，并用trp為載體轉化到E.coliC258中，對其進行發酵培養，D-生物素產量可達150 mg/L。BOWE R等[27]用高生物素和α-脫氫生物素來篩選枯草芽孢桿菌生物素類似物抗性的突變菌株，其原理是bioA基因位點的某個氨基酸序列發生突變，之后將篩選成功菌株的所有bio基因進行過表達，得到菌株B.subtilisBI282，最終以SAM為氨基酸供體用VY培養基對菌株進行發酵，維生素總產量達到了600 mg/L，但其中D-生物素產量卻只有6 mg/L。之后VAN ARSDELL S W等[28]對B.subtilisBI282進行了研究，發現L-賴氨酸比SAM更適合作為枯草芽孢桿菌的氨基酸供體，用L-賴氨酸作氨基酸供體進行發酵的D-生物素產量可達21 mg/L，盡管如此，其D-生物素產量依舊不高。由此可知，對于枯草芽孢桿菌來說，合成D-生物素的最后一步仍然是個瓶頸。SHAW N M等[29]將經修飾的大腸桿菌中的生物素操縱子bioBFCDA連接到pB047上，將構建出質粒Pbo30A-15/9轉化到Agrobacterium/RhizobiumHK4中，上罐發酵最高可產生110 mg/LD-生物素。XIAO F等[30]對異變假單胞菌進行了過表達合成途徑中的限速酶編碼基因，敲除負調控因子，增強輔因子的供應以及引入枯草芽孢桿菌的BioW-BioI途徑這四級代謝工程改造，之后以甘油為碳源將改造好的菌株進行發酵，D-生物素最高產量為272 mg/L，這也是目前除粘質沙雷菌和大腸桿菌外產量最高的D-生物素生產菌株。

由以上報道可知，近年來微生物合成D-生物素的發展十分迅速，但盡管如此，生物法依舊無法與化學法競爭。主要原因還是產量達不到工業化的要求，其中D-生物素生物合成途徑的脫硫生物素到D-生物素是限速步驟，這一過程是由BioB催化的，BioB是一個催化速度很慢的酶（Kcat=0.12 min-1），而過度表達bioB基因還會抑制生物素的轉化[31]。這一步反應依賴氨基酸供體，研究表明，枯草芽孢桿菌的氨基酸供體為L-賴氨酸，其他D-生物素產生菌為SAM。氫鍵可連接BioB保守模體上的天冬酰胺殘基（Asn153）和天冬氨酸殘基（Asp155）與氨基酸供體和脫硫生物素，并與結合在BioB上的[4Fe-4S]2+和[2Fe-2S]2+形成一個類似三角體的結構，其中[4Fe-4S]2+可促進氨基酸供體還原性裂解，而[2Fe-2S]2+可為脫硫生物素形成D-生物素提供硫原子，因此對Fe-S簇的研究是提高BioB 酶活的關鍵[32-33]。同時在構建D-生物素高產菌株的過程中，重組載體質粒構建的穩定性也是D-生物素生物合成的一個瓶頸，過表達參合其生物合成的關鍵基因卻導致生物素產物生成受抑制的機理也要深入研究，此外注意帶有毒性的副產物生成也是重中之重。

3 展望

目前，研究者們正在利用現代生物技術手段來攻克D-生物素生物合成中的瓶頸，尤其是近年來生物信息學以及蛋白質工程的發展十分迅速，可以通過各種計算機軟件對關鍵基因進行深入分析以及計算輔助提高酶的活性[34]，如對bioB基因進行深入分析，并以CRISPR/Cas9基因編輯技術為支撐，可以通過對bioB基因堿基序列的改變來減少密碼子的使用頻率，再利用量子化學計算等操作提高BioB酶的酶活，進而解決脫硫生物素轉化為D-生物素效率低這一瓶頸。隨著生物技術的進步，相信很快可以得到D-生物素高產菌株，以生物法完全代替化學合成，實現D-生物素的綠色生產。