釀造米酒發酵條件的優化

袁華偉，張 健，張雪婷，屠婷瑤，劉光錢，張立強，沈才洪，王松濤

（1.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓 644000；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；3.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；4.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000）

釀造米酒是我國一種傳統的酒精飲品，酒精度一般在5%vol～14%vol，顏色呈淡黃色或乳白色，除具有獨特的香氣、清爽的口感外，還含有豐富的營養成分[1]。米酒中含有適量的麥芽糖等易于吸收的小分子糖類、多種氨基酸（包括8種人體不可缺少的必需氨基酸）、有機酸、礦物質、維生素等[2-5]。傳統中醫學認為米酒具有消食健脾、溫寒補虛、提神解乏、解渴消暑等功效。動物實驗發現，米酒能明顯增加腹腔巨噬細胞的吞噬能力，從而提高免疫能力，還可通過抗氧化作用抑制衰老癥狀[6-7]。隨著人們生活水平的提高，米酒越來越受到消費者的青睞。

我國米酒的釀造具有悠久的歷史，產地分布廣泛。近年來國內對米酒的研究主要集中在對某些特定原料及地域性米酒品質的分析[8-12]、米曲微生物群落結構的研究及相關微生物的分離鑒定[13-16]、新型米酒產品的開發等方面[17]。對米酒生產工藝的研究僅限于利用酒曲發酵及對香氣成分的影響[18-19]，而以米曲霉、釀酒酵母等微生物釀造米酒的發酵工藝條件研究鮮見報道。

米酒種類較多，由于受地域性、工藝技術、生產原料等因素的影響，傳統米酒是用蒸熟的米飯拌上米曲經發酵、過濾而成，受米曲中微生物菌群的影響，造成米酒品質參差不齊，同一企業的產品質量也不穩定。以米曲霉為糖化劑、酵母為發酵劑的米酒生產新工藝可對發酵工藝過程進行控制，以穩定其質量，從而開發出口感協調、香氣較好、質量穩定的米酒。本研究以米曲霉（Aspergillus oryzae）及釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為發酵菌株，采用兩步發酵法研制釀造米酒，通過測定釀造米酒的酒精度、總糖、總酸、風味物質和感官評價等指標，確定最佳的釀造米酒發酵工藝條件，為釀造米酒產業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

大米、麩皮：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）LB-05、米曲霉（Aspergillus oryzae）YM-16：本實驗室篩選，均來源于米曲；傳統米酒：本實驗室以酒曲為糖化發酵劑釀造[18]。

1.1.2 化學試劑

酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸鉀、苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：成都科龍化學試劑廠；白酒色譜混合標樣：鄭州譜析科技有限公司。

1.1.3 培養基

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，121 ℃滅菌20 min。

麩皮培養基：麩皮∶水=1.0∶0.8（g∶mL），121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州合飛凈化設備有限公司；LDZX-75KBS高溫蒸汽滅菌鍋：上海申安有限公司；HHW21-600S恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市正基儀器有限公司；MJ-250-H恒溫恒濕培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；LRH-250恒溫培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司；HEIVAPPRE-CISION旋轉蒸發儀：上海賢德實驗儀器有限公司；7890A氣相色譜分析儀：美國安捷倫科技有限公司；LZP-930色譜柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm）：中科院蘭州化學物理研究所；MX-301離心機：日本Tomy公司。

1.3 方法

1.3.1 釀造米酒工藝流程及操作要點

操作要點：

大米浸泡、蒸煮：大米淘洗2～3遍后，加3倍水于常溫條件下浸泡1 h，濾掉水分，于蒸鍋上蒸煮約1 h，至全部熟透用手捏富有彈性且不粘手時為止。

霉菌孢子懸浮液制備：霉菌菌種接種于麩皮培養基上，每24 h搖動一次，28 ℃培養72 h后加入200 mL滅菌水搖勻，用滅菌后的雙層紗布過濾，濾液即為孢子懸浮液，孢子濃度為105～106個/mL。

米曲制備：大米經除雜清洗、浸泡、蒸煮，冷卻至30～40 ℃左右，分裝在搪瓷盤中，按原料米質量的1%加入孢子懸浮液。控制溫度為38 ℃、相對濕度為95%。培養48 h后，攤開混合均勻再堆積，在32 ℃和95%相對濕度條件下培養24 h。最后控制溫度至40 ℃，相對濕度50%，保持12 h，干燥后得到米曲[20]。

酒母制備：取酵母菌于YPD液體培養基內，在25 ℃恒溫條件下培養，每日搖動混勻1～2次，2～3 d后至酵母數（1.0～1.5）×108個/mL，即得釀造米酒所需酒母。

第一次發酵：稱取米曲82.5 g放入1 000 mL三角瓶中，加入100 mL滅菌水，再加入酒母1 mL，混合均勻后，置于25℃恒溫箱中培養3d，每天搖動一次，進行米酒的一次發酵。

第二次發酵：取250 g大米，經除雜清洗、浸泡、蒸煮，冷卻后加入一次發酵后的三角瓶中，并加入450 mL無菌水。在恒溫箱中進行二次發酵，每天搖動一次，過濾后的清液即得釀造米酒[21]。

1.3.2 釀造米酒發酵條件的優化

分別使酵母接種量為原料大米量的0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%，在21 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃、29 ℃條件下進行發酵1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、13 d、15 d、17 d。考察接種量、發酵溫度及發酵時間對釀造米酒品質的影響。

1.3.3 不同方法釀造米酒的品質特性

分析兩步發酵方法和傳統方法生產的米酒中酒精度、總糖、總酸、風味物質等理化指標，并進行感官品評，比較不同方法釀造米酒的品質。

1.3.4 分析方法

酒精度：采用氣相色譜法測定[21]；總酸含量：采用酸堿滴定法測定[22]；總糖含量：采用DNS法測定[23]。

米酒中的風味物質含量采用氣相色譜法檢測。樣品處理方法：米酒在2 300×g、4 ℃條件下離心5 min，上清液經0.22μm薄膜過濾器過濾。氣相色譜條件如下：載氣為高純氮氣（N2），氫氣（H2）流量為30 mL/min，空氣流量為400 mL/min；進樣溫度及檢測溫度均為220 ℃，進樣量0.4 μL，分流比10∶1；柱溫55 ℃，保持3 min，以3.5 ℃/min的速率升溫至150 ℃，保持1 min；以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持30 min。以保留時間定性、內標法計算各風味物質的含量。

1.3.5 米酒中風味物質的氣味活性值計算

以傳統自然發酵的米酒為對照，根據測定的米酒風味物質含量，通過風味成分的嗅覺閾值，按如下公式計算各種成分的氣味活度值（odor activity value，OAV），其計算公式如下：

式中：C1表示風味物質的含量，mg/mL；C0表示風味物質的閾值，μg/L。

依據米酒風味物質的OAV值作米酒風味輪廓圖。

1.3.6 感官評定

參考GB/T 13662—2018《黃酒》中的感官評定方法，組建感官評定小組，對釀造米酒的外觀、香氣、滋味、整體協調度4個方面進行評價[24]，滿分100分，感官評定標準見表1。

表1 釀造米酒的感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of brewed rice wine

1.3.7 數據處理

試驗數據以均值±標準差表示，采用Excel 2010作圖；采用SPSS 16.0進行單因素方差分析，顯著性水平為0.05，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同酵母接種量對釀造米酒的影響

由表2可知，風味物質中乙醛、正丙醇的含量差異較大（P＜0.05）。乙酸β-苯乙酯的含量差異不顯著（P＞0.05），乙酸在接種量0.8%～1.0%及1.2%～1.6%時有顯著差異（P＜0.05）。接種量為1.0%時，釀造米酒中乙酸乙酯、異戊醇、β-苯乙醇、乙酸異戊酯含量較高。

由表3可知，接種量1.4%時米酒的酒精度最高（14.59%vol），但其總糖含量最低（0.64 g/L）；接種量1.2%時的總酸最高（1.94 g/L）。釀造米酒的米曲霉含豐富的淀粉酶、蛋白酶等酶類，酶解淀粉為糖類，還產檸檬酸、乳酸等有機酸[25]，所以米酒中含有糖分和有機酸。接種量大，酵母生長旺盛，產酒能力就強；總糖和總酸含量的變化，可能是由于酵母和米曲霉中的酶相互作用的結果。適量的糖和酸能提高米酒品質，從理化指標結果來看，接種量1.0%為宜。感官品評結果顯示，接種量0.8%、1.2%時的米酒感官品評得分較低，原因可能是在發酵過程中產生了不利于口感的物質。接種量1.0%時發酵的米酒感官品評得分最高（81.62分），在口感上相對較好，總酸和總糖含量比較適宜，米酒酸甜適口。從感官得分結果來看，酵母接種量1.0%為宜。

表2 不同酵母接種量對發酵米酒的揮發性風味物質含量的影響Table 2 Effect of different yeast inoculum on volatile flavor compounds contents of brewed rice wine

表3 不同酵母接種量對釀造米酒理化指標和感官評分的影響Table 3 Effect of different yeast inoculum on physiochemical indexes and sensory score of brewed rice wine

2.2 發酵溫度對釀造米酒的影響

由表4可知，不同發酵溫度乙醛、乙酸異戊酯的含量有顯著差異（P＜0.05）；β-苯乙醇差異不顯著（P＞0.05）。25 ℃發酵的米酒中乙酸異戊酯、乙酸β-苯乙酯的含量最高，分別為4.06 mg/L、26.94 mg/L。異戊醇、β-苯乙醇隨發酵溫度的升高略有減少，原因可能是較高的溫度導致相關的酶類活性降低。

由表5可知，不同發酵溫度條件下釀造米酒在酒精度和酸度上差別不顯著（P＞0.05）；21～23 ℃及25～29 ℃發酵時有顯著差異（P＜0.05）。21 ℃時釀造米酒的總糖量最高，為1.49 g/L。可能是隨著發酵溫度的升高，米曲霉的酶活性受到影響，造成分解淀粉的能力降低，發酵溫度較高時釀造米酒的總糖量較少。由于米酒發酵過程中的溫度適宜酵母菌的作用，不同發酵溫度對酒精度和酸度的影響不大。25 ℃發酵的釀造米酒感官品評得分最高（81.18分）。糖度和酸度對米酒口感的影響較大，25 ℃發酵時釀造米酒風味物質的含量較協調，口感也相對較好，曲霉菌產酶活性最佳[25]。因此，確定釀造米酒的最適發酵溫度為25 ℃。

表4 不同發酵溫度對釀造米酒揮發性風味物質含量的影響Table 4 Effect of different fermentation temperature on volatile flavor compounds contents of brewed rice wine

表5 不同發酵溫度對釀造米酒理化指標和感官評分的影響Table 5 Effect of different fermentation temperature on physiochemical indexes and sensory score of brewed rice wine

2.3 發酵時間對米酒品質的影響

由表6可知，隨著發酵時間的延長，釀造米酒的風味物質含量也隨著增加，在發酵前5 d，釀造米酒的風味物質含量快速上升，在發酵13 d時趨于穩定。釀造米酒特征香氣成分乙酸β-苯乙酯、β-苯乙醇的含量在發酵前5 d分別從6.12 mg/L、4.62 mg/L上升至18.63 mg/L、87.76 mg/L，到13 d時緩慢上升至23.47 mg/L、120.22 mg/L。到發酵13 d后，釀造米酒中風味物質含量的差異不顯著（P＞0.05），延長發酵時間增加米酒中風味物質含量的意義不大，13 d的發酵時間較為適宜。

表6 不同發酵時間對釀造米酒揮發性風味物質含量的影響Table 6 Effect of different fermentation time on volatile flavor compounds contents of brewed rice wine

續表

表7 不同發酵時間對釀造米酒理化指標和感官評分的影響Table 7 Effect of different fermentation time on physiochemical indexes and sensory score of brewed rice wine

由表7可知，在發酵前5 d，釀造米酒的酒精度快速上升，從2.39%vol上升至12.71%vol，隨后酒精度變化不大，發酵13 d米酒酒精含量為13.21%vol。發酵前3 d釀造米酒釀造體系中的淀粉水解酶起作用，將淀粉水解為糖類，總糖含量有所上升，3～5 d時酵母利用糖類產酒，總糖含量快速下降，從19.74 g/L下降至2.62 g/L，與酒精含量的變化趨勢相反；前期總酸含量緩慢上升。7 d后的總酸、總糖含量趨于穩定，是由于釀造體系中的可發酵性糖被利用完及少有酸產生。從理化指標結果來看，發酵時間13 d為宜。且此條件下時釀造米酒口感較好，感官品評得分最高，為87.14分。因此，確定米酒的最適發酵時間為13 d。

2.4 釀造米酒的風味特征

采用不同方法釀造米酒的理化指標和感官得分見表8，相關揮發性風味物質的嗅覺閾值、感官描述風味物質含量和OAV見表9，選擇OAV較高的風味物質為主體特征作米酒的風味輪廓圖見圖1。

表8 兩種米酒的理化指標和感官評分Table 8 Physiochemical indexes and sensory score of two kinds of rice wine

由表8可知，釀造的米酒和傳統米酒的酒精度、總酸、總糖和感官評分有顯著差異（P＜0.05）。釀造米酒酒精度和感官評分較高，而總酸、總糖較低，可能是由于傳統方法釀造過程中對糖的利用較好，受雜菌污染產生了較多的酸。

表9 兩種米酒中風味物質的嗅覺閾值及香氣活性值Table 9 Olfactory threshold and OAV of flavor compounds in two kinds of rice wine

由表9可知，米酒特征香氣成分乙酸β-苯乙酯、β-苯乙醇的含量無顯著差異（P＞0.05），表明釀造米酒與傳統米酒的風味無明顯差異；其他成分除異丁醇外具有顯著差異（P＜0.05）。不同揮發性組分的氣味閾值顯著不同，含量較低的物質可能由于其閾值極其低，使得其OAV非常高。通常認為OAV＞1的物質對米酒的風味有貢獻，OAV＞10的則認為是重要香氣物質[29]。

圖1 米酒風味輪廓特征Fig.1 Aroma characteristics of rice wine

選擇OAV較高的風味物質為主體特征，包括具有香蕉香味的乙酸異戊酯、具有花香味的乙酸β-苯乙酯、具有蘋果香味的己酸乙酯、具有青草味的乙縮醛和醇香味的正丁醇。由圖1可知，釀造米酒與傳統米酒的主體風味特征為水果香和花香，并有醇香和青草香等；顏色呈米黃色，酒體豐滿醇和，香氣自然純正。

3 結論

釀造米酒的適宜酵母菌接種量為1.0%，最佳發酵工藝參數為發酵溫度25 ℃、發酵時間為13 d。在此最佳條件下，釀造米酒酒精度13.21%vol，總酸1.37 g/L，總糖0.95 g/L，感官評分87.14分。米酒關鍵香氣物質乙酸β-苯乙酯、β-苯乙醇的含量分別為23.47 mg/L、120.22 mg/L，釀造米酒的主體風味特征為水果香、花香和醇香等，口感較好，與傳統發酵米酒的風味特征無明顯差異，可為釀造米酒的產業化生產提供理論依據。