圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性及其抗氧化性研究

管敬喜，廖秋眉，黃 羽，黃江流，黃 竟，盤豐平，楊 瑩

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，南寧 530007；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，南寧 530007）

圓葉葡萄（Vitis rotundifolia）為葡萄科（Vitaceae）圓葉葡萄亞屬，起源于美國東南部地區(qū)[1]。圓葉葡萄引種至我國，已在廣西、浙江、成都[2-3]等地栽植成功，且可實(shí)現(xiàn)一年兩熟。圓葉葡萄品種顏色有綠色、銅色、紅色、黑色等，果實(shí)具有特殊的芳香和風(fēng)味，既可鮮食，又可加工成果酒、果汁、果脯、果醬等[4]。圓葉葡萄具有良好的抗氧化、抗菌、消炎、抗癌等功效[5-7]，這些都得益于其含有的多種酚類物質(zhì)。圓葉葡萄的果皮和種子中含有大量的兒茶素、表兒茶素及其多聚體，還含有鞣花酸、沒食子酸、山柰酚、槲皮素等[8]。

原花色素（proanthocyanidins，PAs）是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，由兒茶素、表兒茶素單體和不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素聚合體組成[9]，能夠抗氧化、清除自由基，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[10]。葡萄籽中的原花色素，是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑[11]。葡萄籽中所含多酚類物質(zhì)占整個(gè)葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)的60%左右，葡萄籽中酚類物質(zhì)原花色素含量高達(dá)90%以上，因此提取原花色素的最好原料為葡萄籽[12]。

本研究對諾貝爾（Noble）圓葉葡萄籽所提取的原花色素的穩(wěn)定性及抗氧化性進(jìn)行研究，以期為圓葉葡萄進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圓葉葡萄籽：取自發(fā)酵后的諾貝爾（Noble）圓葉葡萄皮渣中，葡萄產(chǎn)地為廣西都安縣。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（葡萄籽提取物，含原花色素95%）：上海源葉生物科技有限公司。

1,1-二苯-1-苦基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryhydrazy1，DPPH）（分析純）：美國Sigma公司；硫酸亞鐵、三氯化鐵、香草醛、抗壞血酸（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；鐵氰化鉀（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚、過氧化氫（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；濃鹽酸（分析純）：廉江市愛廉化試劑有限公司；無水乙醇、甲醇（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂（均為分析純）：天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1801紫外/可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金怡醫(yī)療儀器廠；FA2004N分析天平：上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；雷磁pH-3C酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 圓葉葡萄籽中原花色素提取

把葡萄籽粉碎后，加一定量的石油醚浸泡脫脂，干燥。以料液比1∶20（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液超聲波浸提20 min后，50 ℃水浴80 min，得到原花色素提取液，3 000 r/min離心10 min后置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆肹13-14]。

1.3.2 圓葉葡萄籽原花色素的光譜特性

取一定量的原花色素提取液，用UV-1801紫外/可見分光光度計(jì)在波長350～700 nm范圍內(nèi)測定其吸光度值，繪制特征吸收光譜。

1.3.3 原花色素含量的測定

采用香草醛-鹽酸法[15]：準(zhǔn)確稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL定容至10 mL。各取1.00 mL（另取1.00 mL甲醇液為空白液）于比色管中，分別加入5.00 mL顯色劑，搖勻后在30 ℃避光水浴30 min，然后測定A500nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.773 3x+0.007 2（其中y為吸光度值，x為原花色素質(zhì)量濃度，R2=0.999 1）。

1.3.4 圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的研究

溫度對原花色素穩(wěn)定性的影響：量取一定的原花色素提取液，分別于20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、95 ℃條件下避光保溫，每隔0.5 h取樣冷卻后，測定其吸光度值。

pH值對原花色素穩(wěn)定性的影響：量取一定的原花色素提取液，配制成pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的溶液，混勻后室溫避光放置4 h、8 h、12 h、24 h、48 h后，測其吸光度值。

金屬離子對原花色素穩(wěn)定性的影響：量取一定的原花色素提取液，分別加入濃度相等的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+溶液，混勻后室溫避光放置，設(shè)對照，按2 h、24 h、48 h取樣測定其吸光度值。

還原劑、氧化劑對原花色素穩(wěn)定性的影響：量取一定的原花色素提取液，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.5%、1.0%的抗壞血酸溶液和過氧化氫溶液，混勻后室溫避光放置，設(shè)對照，每天取樣測定其吸光度值。

光照對原花色素穩(wěn)定性的影響：量取一定的原花色素提取液，置于室內(nèi)避光、室內(nèi)自然光條件下，每5天取樣測定其吸光度值。

1.3.5 圓葉葡萄籽原花色素體外抗氧化活性的測定

DPPH自由基（DPPH·）清除率的測定[16]：取不同濃度樣品各0.2 mL倒入試管，加入3.8 mL質(zhì)量濃度為80 mg/L DPPH·的無水乙醇溶液，搖勻，室溫條件下黑暗處放置30 min，于波長517 nm處分別測定吸光度值A(chǔ)i；另取不同濃度樣品各0.1 mL倒入試管，加入3.9 mL無水乙醇，于波長517 nm處分別測定參比吸光度值A(chǔ)b；再取0.1 mL無水乙醇，加入3.9 mL 80 mg/L的DPPH·無水乙醇溶液，于波長517 nm處測定空白吸光度值A(chǔ)0，計(jì)算DPPH·清除率，其計(jì)算公式如下：

羥基自由基（·OH）清除率的測定[16]：取不同濃度樣品各2 mL倒入試管，加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，再加入6 mmol/LH2O2溶液，搖勻，靜置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，搖勻，靜置30 min。于波長510 nm處分別測定其吸光度值A(chǔ)i；另用蒸餾水代替水楊酸溶液重復(fù)上述試驗(yàn)，測得參比吸光度值A(chǔ)b；另用蒸餾水代替樣品溶液重復(fù)上述試驗(yàn)，測得空白吸光度值A(chǔ)0，計(jì)算·OH清除率，其計(jì)算公式如下：

還原力（鐵離子還原能力）的測定[17]：將5 mL原花色素溶液、1 mL、pH 6.6、0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液和1.0 mL 1%的鐵氰化鉀混勻，于50 ℃水浴反應(yīng)20 min后急速冷卻。然后在上述溶液中加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL。在上清液中加入2.0 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，10 min后于波長700 nm處測定其吸光度值。吸光度值越高說明樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Office 2010統(tǒng)計(jì)和處理各數(shù)據(jù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓葉葡萄籽原花色素的光譜特性

圓葉葡萄籽原花色素在波長350～700 nm之間有一最大吸收峰，該峰峰值在波長500 nm處，因此選定500 nm作為最佳吸收波長。

2.2 圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的研究

2.2.1 溫度對圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的影響

圖1 溫度對原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of temperature on the stability of proanthocyandin

由圖1可知，溫度為20 ℃、40 ℃、60 ℃時(shí)，原花色素溶液吸光度值隨時(shí)間的延長，無顯著變化。溫度為80 ℃時(shí)，其原花色素溶液吸光度值相較于20 ℃、40 ℃、60 ℃緩慢升高，但增幅不大。在95 ℃條件下，隨著加熱時(shí)間的延長，原花色素溶液吸光度值則顯著上升，顏色由橘黃色變?yōu)楹稚舛戎得黠@變大。這可能是由于高溫條件下葡萄籽原花色素受熱分解為其他物質(zhì)所致[18]。由此可說明圓葉葡萄籽原花色素在溫度低于80 ℃時(shí)具有良好的穩(wěn)定性，但更適合于低溫條件下保存和應(yīng)用。

2.2.2 pH值對圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的影響

圖2 pH值對原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of pH on the stability of proanthocyandin

由圖2可知，不同pH對原花色素的影響差異較大，特別是pH≤3、pH≥9時(shí)，原花色素溶液吸光度值隨著時(shí)間的推移而顯著變小，而當(dāng)pH為4～8時(shí)，原花色素溶液吸光度值下降不明顯，穩(wěn)定性較好。由此可見，酸性或堿性過強(qiáng)都會(huì)破壞原花色素的結(jié)構(gòu)，在弱酸、弱堿性（pH4～8）條件下其相對比較穩(wěn)定。

2.2.3 金屬離子對圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的影響

圖3 金屬離子對原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of metal ions on the stability of proanthocyandin

由圖3可知，在含有K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+金屬離子的溶液中，原花色素的吸光度值隨時(shí)間變化不明顯，與對照組變化相似，對原花色素穩(wěn)定性影響不大。而當(dāng)原花色素遇Cu2+時(shí)，溶液顏色立刻轉(zhuǎn)變?yōu)樽鼐G色，吸光度值明顯減小；加入Fe3+后溶液顏色立刻轉(zhuǎn)為綠褐色，并帶有輕微渾濁現(xiàn)象，吸光度值減小，常溫放置24 h后有絮狀沉淀產(chǎn)生。由此可以看出Cu2+、Fe3+對原花色素有明顯的破壞作用。

2.2.4 還原劑、氧化劑對原花色素穩(wěn)定性的影響

圖4 抗壞血酸對原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of ascorbic acid on the stability of proanthocyandin

由圖4可知，與對照相比，抗壞血酸對原花色素的影響不明顯。0.1%抗壞血酸對原花色素幾乎無影響，而0.5%和1%抗壞血酸隨著時(shí)間的延長，引起原花色素溶液吸光度值小幅下降。因此，還原劑抗壞血酸對圓葉葡萄籽中原花色素?zé)o明顯的破壞作用。

由圖5可知，與對照相比，0.1%與0.5%過氧化氫溶液對原花色素穩(wěn)定性影響較小，而1.0%過氧化氫溶液對原花色素影響較大，吸光度值明顯下降，表明氧化劑濃度越高，對原花色素溶液破壞越大。

圖5 過氧化氫對原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of hydrogen peroxide on the stability of proanthocyandin

2.2.5 光照對圓葉葡萄籽原花色素穩(wěn)定性的影響

圖6 光照對原花色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of light on the stability of proanthocyandin

由圖6可知，在室溫條件下，圓葉葡萄籽原花色素易受光照影響，隨著時(shí)間的延長，原花色素的吸光度值逐漸下降。避光條件下原花色素的穩(wěn)定性明顯較好，其降解速度較慢，在使用和保存時(shí)應(yīng)該避光處理。

2.3 圓葉葡萄籽原花色素體外抗氧化活性分析

2.3.1 圓葉葡萄籽原花色素對DPPH·的清除作用

原花色素分子中含有大量的酚羥基，使其具有強(qiáng)大的抗氧化和自由基清除能力[19]。

圖7 原花色素對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of proanthocyandin on DPPH free radical

由圖7可知，當(dāng)原花色素溶液質(zhì)量濃度在0.01～0.1mg/mL范圍內(nèi)，圓葉葡萄籽原花色素對DPPH自由基具有清除作用，隨著原花色素質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，并且在原花色素用量很低的情況下，清除率仍可高達(dá)90%以上，由此得出，葡萄籽原花色素具備一定的清除DPPH自由基的能力。

2.3.2 圓葉葡萄籽原花色素對·OH的清除作用

H2O2與Fe2+反應(yīng)生成的羥基自由基能與水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，可由溶液顏色的變化程度，來評價(jià)原花色素物質(zhì)抗氧化活性的高低[20]。

圖8 原花色素對·OH的清除作用Fig.8 Scavenging effect of proanthocyandin on hydroxyl radical

由圖8可知，在選定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，原花色素溶液對羥基自由基有較好的清除作用，其清除效果與原花色素溶液的添加量呈正相關(guān)。當(dāng)原花色素質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到59.12%。葡萄籽原花色素具備一定的清除羥基自由基的能力。

2.3.3 圓葉葡萄籽原花色素的鐵離子還原能力

圖9 原花色素的鐵離子還原能力Fig.9 Iron reducing power of proanthocyandin

由圖9可知，圓葉葡萄籽原花色素具有一定的還原能力，當(dāng)質(zhì)量濃度＜0.08 mg/mL時(shí)，隨質(zhì)量濃度增加，吸光度值增加幅度明顯，原花色素還原力逐漸增強(qiáng)，還原能力顯示出一定的量效關(guān)系；當(dāng)質(zhì)量濃度＞0.08 mg/mL時(shí)，隨質(zhì)量濃度增大，吸光度值變化趨緩，原花色素還原能力增加緩慢。

3 結(jié)論

通過溫度、pH、金屬離子、氧化劑還原劑、光照五個(gè)因素對圓葉葡萄籽原花色素的穩(wěn)定性影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，圓葉葡萄籽原花色素在溫度低于80 ℃時(shí)具有良好的穩(wěn)定性，pH 4～8范圍內(nèi)該原花色素較穩(wěn)定；金屬離子K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+對原花色素的穩(wěn)定性影響不明顯，而Cu2+、Fe3+有明顯的破壞作用；抗壞血酸對原花色素?zé)o明顯影響，過氧化氫則顯著降低其穩(wěn)定性；較長時(shí)間的光照對其穩(wěn)定性不利。抗氧化試驗(yàn)表明，圓葉葡萄原花色素對DPPH·、·OH有明顯的清除效果，并具有一定的還原能力。

綜上，圓葉葡萄籽原花色素的加工儲(chǔ)藏過程中應(yīng)在避光、低溫、弱酸環(huán)境中進(jìn)行，并應(yīng)避免與氧化劑及鐵、銅器皿的接觸。