混菌發(fā)酵產(chǎn)酶活性與蘋果酒風味物質(zhì)構(gòu)成的相關(guān)性分析

曾朝珍 ，康三江 ，張輝元，慕鈺文，袁 晶，張海燕，張霽紅，宋 娟，張 芳

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省果蔬貯藏加工技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅蘭州 730070）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是釀酒過程中的重要發(fā)酵劑，在釀酒過程中具有易控制、產(chǎn)物均一性好等優(yōu)點[1]，也可以調(diào)節(jié)微生物群落的多樣性及其代謝[2]。然而，為了改善果酒的香氣、復(fù)雜性及口感，非釀酒酵母（non-Saccharomyces）也被應(yīng)用到果酒釀造中，這些非釀酒酵母也負責酒精發(fā)酵，并會影響最終產(chǎn)品的感官特性[3-5]。在發(fā)酵過程中非釀酒酵母能夠分泌糖苷酶、果膠酶、蛋白酶以及脂肪水解酶等多種酶類，這些酶與前體物質(zhì)相互作用能夠產(chǎn)生使酒體有更濃郁發(fā)酵香味的化合物，從而整體提升產(chǎn)品質(zhì)量[6-9]。非釀酒酵母由于酒精發(fā)酵力較弱，為了能夠保證完全發(fā)酵，將釀酒酵母與非釀酒酵母混合發(fā)酵以提高果酒質(zhì)量。混合培養(yǎng)中，非釀酒酵母和釀酒酵母相互作用產(chǎn)生了不同的反應(yīng)，從而對果酒品質(zhì)變化也產(chǎn)生了不同的影響[10-14]。此外，一些研究也揭示了果酒釀造和發(fā)酵中的酶活性[6-9，15]。然而，混合菌種發(fā)酵實際上是一個復(fù)雜的微生物代謝過程，微生物在產(chǎn)生風味的化學(xué)反應(yīng)中占主導(dǎo)地位，微生物的代謝，包括碳水化合物的水解，蛋白水解和脂質(zhì)水解，決定了風味的類型和強度[16]。風味是消費者對果酒認可度的重要指標，還沒有已知的報道將發(fā)酵過程中釀酒酵母和非釀酒酵母混合培養(yǎng)中酶活性的產(chǎn)生與蘋果酒的最終香氣特征聯(lián)系起來。本試驗以甘肅富士蘋果為原料，采用德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）與釀酒酵母以不同的發(fā)酵方式研制蘋果酒。通過測定酶活性及揮發(fā)性香氣物質(zhì)，研究蘋果汁發(fā)酵過程中酶活性對蘋果酒品質(zhì)的影響，不僅可以拓展對混菌發(fā)酵條件下非釀酒酵母對果酒發(fā)酵過程中果酒品質(zhì)改良的認識，也可為釀造高品質(zhì)果酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌種

蘋果（品種為富士）：甘肅省慶陽市；德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii，Td）1004、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）32168：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司。

1.1.1 化學(xué)試劑

甲醇、3-辛醇、乙酸正戊酯（均為色譜純）：美國Sigma公司；β-葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶、果膠酶檢測試劑盒：蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BPC-70F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；MIRCOCL 17R離心機、Multiskan GO 1510全波長酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；QP2020 SYSTEM氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：日本島津公司；XB-K-25血球計數(shù)板：上海市求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將德爾布有孢圓酵母1004和釀酒酵母32168用接種環(huán)挑取2～3環(huán)菌苔接種于裝液量為100 mL/250 mL液體PDA培養(yǎng)基中，然后在28 ℃靜置培養(yǎng)72 h后用血球計數(shù)板確定菌種濃度，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蘋果酒釀造工藝

參照曾朝珍等[15]的接種方式及發(fā)酵工藝制備蘋果酒，富士蘋果榨汁后，將德爾布有孢圓酵母（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）1004）與釀酒酵母（CICC 32168）按單菌培養(yǎng)（Td 1004和Sc 32168，106CFU/mL）和混合培養(yǎng)（mixed cultures ofS.cerevisiaeandT.delbrueckii，MST）1：105CFU/mLS.cerevisiae/106CFU/mLT.delbrueckii；MST2：104CFU/mLS.cerevisiae/106CFU/mLT.delbrueckii）在接種量為6%條件下接種到800 mL蘋果汁中，20 ℃條件下進行恒溫發(fā)酵直至恒質(zhì)量。測定蘋果酒發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶、果膠酶、酸性蛋白酶及α-淀粉酶活性及發(fā)酵結(jié)束后蘋果酒的揮發(fā)性香氣成分含量。

1.3.3 測定方法

（1）酶活的測定

參照曾朝珍等[15]的方法測定β-葡萄糖苷酶、果膠酶、酸性蛋白酶及α-淀粉酶酶活性。

（2）揮發(fā)性香氣化合物測定

參照曾朝珍等[14]的方法測定揮發(fā)性香氣成分。

樣品預(yù)處理方法：取1 mL酒樣，加入1 mL甲醇，50 μL 3-辛醇內(nèi)標（630.8mg/L），100μL乙酸正戊酯內(nèi)標（219.35 mg/L），漩渦混勻。取1 mL氣相色譜瓶自動進樣。

GC條件：進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣（He），流速1.2 mL/min。進樣量1 μL，不分流進樣。色譜柱為TB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序40 ℃恒溫2 min，以5 ℃/min的升溫速度升至180 ℃，以15 ℃/min的升溫速度升至250 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃。掃描范圍33.00～350.00 amu。

定量分析：采用內(nèi)標法進行半定量分析。酯類香氣成分計算用乙酸正戊酯為內(nèi)標，醇類用3-辛醇為內(nèi)標，待測化合物質(zhì)量濃度計算公式如下：

式中：ρ1為待檢化合物的質(zhì)量濃度，mg/L；ρ0為加入的內(nèi)標化合物的質(zhì)量濃度，mg/L；A1，待檢化合物的峰面積；A0為加入的內(nèi)標化合物的峰面積；V1為每次萃取的1.0 mL稀釋樣品的體積，mL；V0為加入的內(nèi)標化合物的體積，μL。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

通過Excel 2003對試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用IBM SPSS Statistics 24.0和SIMCA14.1等軟件對數(shù)據(jù)進行分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果酒發(fā)酵過程中酶活性的變化

蘋果酒整個發(fā)酵過程中相關(guān)酶活性出現(xiàn)了波動，它們的水平在整個發(fā)酵過程中都不是恒定的[15]。這意味著發(fā)酵過程中有大量的生化反應(yīng)發(fā)生。因此，為了恰當?shù)谋磉_酶在整個過程中的行為，不同發(fā)酵方式產(chǎn)生水解酶的酶活性以曲線下面積（area under curve，AUC）表示，結(jié)果見表1。由表1可知，在純培養(yǎng)發(fā)酵中，酸性蛋白酶和果膠酶的曲線下面積有顯著差異性（P＜0.05），而β-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的曲線下面積差異不顯著（P＞0.05）。混合培養(yǎng)中，產(chǎn)生水解酶的曲線下面積差異顯著性與純培養(yǎng)相同，且MST2中酸性蛋白酶和果膠酶的曲線下面積都顯著高于MST1（P＜0.05）。

表1 不同發(fā)酵方式產(chǎn)生水解酶的曲線下面積Table 1 Area under curve of hydrolytic enzymes produced by different fermentation methods

2.2 不同發(fā)酵方式下蘋果酒揮發(fā)性香氣成分分析

對不同發(fā)酵方式下蘋果酒揮發(fā)性香氣成分進行定量分析，總離子流色譜圖見圖1～圖4，各揮發(fā)性香氣成分檢測結(jié)果見表2。由表2可知，共鑒定出83種芳香族化合物，包括酯類、醇類、酸類、醛酮類。發(fā)酵過程中微生物的相互作用會影響香氣成分的來源和產(chǎn)生[17]，不同發(fā)酵方式下香氣成分的濃度差異具有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。德爾布有孢圓酵母1004單獨發(fā)酵中的酯類化合物含量最高為122.84 mg/L，而混合發(fā)酵中酯類化合物的含量比單菌培養(yǎng)更高并且其中一些酯類物質(zhì)含量明顯高于其各自單菌培養(yǎng)中的含量；德爾布有孢圓酵母1004單獨發(fā)酵醇類物質(zhì)含量最低為322.23 mg/L，而混合發(fā)酵醇類物質(zhì)含量明顯高于單獨發(fā)酵含量。酸類物質(zhì)含量在不同發(fā)酵方式下含量差異顯著，其中，單菌培養(yǎng)條件下德爾布有孢圓酵母1004 產(chǎn)生的總酸含量較高為424.99 mg/L，而在混菌發(fā)酵條件下MST2具有最高的總酸含量為587.79 mg/L；醛酮類物質(zhì)在釀酒酵母32168單獨發(fā)酵下含量最低為49.04 mg/L，另外，混合發(fā)酵的醛酮類物質(zhì)含量顯著高于單獨發(fā)酵中醛酮類物質(zhì)，尤其是MST1中含量最高為371.93 mg/L。

圖1 釀酒酵母32168發(fā)酵蘋果酒揮發(fā)性成分總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in cider by Saccharomyces cerevisiae 32168 fermentation

圖2 德爾布有孢圓酵母1004發(fā)酵蘋果酒揮發(fā)性成分總離子色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in cider by Torulaspora delbrueckii 1004 fermentation

圖3 MST1混合發(fā)酵蘋果酒揮發(fā)性成分總離子色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of volatile components in cider by mixed-strain fermentation of MST1

圖4 MST2混合發(fā)酵蘋果酒揮發(fā)性成分總離子色譜圖Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in cider by mixed-strain fermentation of MST2

表2 不同發(fā)酵方式蘋果酒中揮發(fā)性香氣成分測定結(jié)果Table 2 Determination results of volatile components in cider by different fermentation methods

續(xù)表

續(xù)表

2.3 混合發(fā)酵中酶活性與揮發(fā)性香氣成分相關(guān)性分析

為了研究蘋果酒混合發(fā)酵中酶活性與風味物質(zhì)的相關(guān)性，本實驗采用偏最小二乘回歸分析（partial least-squares regression，PLSR）對所得結(jié)果進行統(tǒng)計分析。利用SIMCA-P軟件，以不同混合發(fā)酵方式中的酶活性（AUC值）作為自變量，揮發(fā)性風味物質(zhì)含量作為因變量，進行多個自變量對于多個因變量的回歸建模。分別建立酶活性和酯類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、酸類物質(zhì)和醛酮類物質(zhì)的若干模型，分析混合發(fā)酵過程中酶活性與風味物質(zhì)變化的相關(guān)性。

2.3.1 混合發(fā)酵酶活性與酯類物質(zhì)的相關(guān)性分析

以兩種不同混合發(fā)酵方式中的β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果膠酶的酶活性（AUC值）作為自變量X，以15種酯類物質(zhì)作為因變量Y，建立偏最小二乘回歸分析（PLSR）模型。對構(gòu)建的PLSR模型提取兩種變量的主成分進行相關(guān)性載荷分析，結(jié)果見圖5。

圖5 酶活性與酯類物質(zhì)的相關(guān)性Fig.5 Correlation between enzyme activity and esters

根據(jù)自變量X與因變量Y在坐標中的位置遠近，判斷它們之間的相關(guān)性大小。由圖5可知，酸性蛋白酶和果膠酶與2-氧代-丙酸甲酯（B3）、乙酸1，2-環(huán)氧-3-丙酯（B15）呈現(xiàn)極強的相關(guān)性（P＜0.01），與甲瓦龍酸內(nèi)酯（B12）較強相關(guān)性（P＜0.05）；α-淀粉酶與2-羥基-γ-丁內(nèi)酯（B8）呈現(xiàn)較強相關(guān)性（P＜0.05），而β-葡萄糖苷酶與2-丙烯酸甲酯（B2）、硅烷二醇二甲酯（B4）、1,2-乙二醇單乙酸酯（B6）和硫酸二丁酯（B14）呈現(xiàn)極強相關(guān)性（P＜0.01），而與5-氧代-4-己內(nèi)酯（B7）呈現(xiàn)較強相關(guān)性（P＜0.05）。本研究中，混合菌種發(fā)酵中β-葡萄糖苷酶的酶活性（AUC值）由單菌種發(fā)酵中的10.65 nmol/（min·mL）和10.31 nmol/（min·mL）增加到了15.11 nmol/（min·mL）和14.33 nmol/（min·mL），與非酵母菌混合發(fā)酵可能有助于蘋果酒中酯類物質(zhì)含量的提高[18]，而本研究中多變量分析結(jié)果表明是因為混合發(fā)酵中分泌β-D-葡萄糖苷酶較高，在此條件下與其相關(guān)性較強的酯類物質(zhì)含量較單菌種發(fā)酵高。

2.3.2 混合發(fā)酵酶活性與醇類物質(zhì)的相關(guān)性分析

以兩種不同混合發(fā)酵方式中的β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果膠酶的酶活性（AUC值）作為自變量X，以24種醇類物質(zhì)作為因變量Y，建立模型PLSR。對構(gòu)建的PLSR模型提取變量的主成分進行相關(guān)性載荷分析，結(jié)果見圖6。

圖6 酶活性與醇類物質(zhì)的相關(guān)性Fig.6 Correlation between enzyme activity and alcohols

由圖6可知，酸性蛋白酶和果膠酶與2-甲基-1-丁醇（C3）、[R-（R*，R*）]-2,3-丁二醇（C6）、2-呋喃甲醇（C9）、4-羥基苯乙醇（C18）和1-丙氧基-2-丙醇（C24）相關(guān)性極強（P＜0.01），2-苯乙醇（C11）與果膠酶相關(guān)性較強（P＜0.05），對于3-甲基-1-丁醇（C4）、異山梨醇（C16）、3-呋喃甲醇（C21）和2,4-戊二醇（C22），與β-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出極強的相關(guān)性（P＜0.01），而2-環(huán)己烯-1-醇（C19）表現(xiàn)出較強相關(guān)性（P＜0.05）。而α-淀粉酶與醇類組分無明顯相關(guān)性。混合培養(yǎng)中醇類物質(zhì)的含量也有增加，其中MST2混合培養(yǎng)中3-甲基-1-丁醇、[R-（R*，R*）]-2,3-丁二醇和2-苯乙醇的含量最高分別為44.88 mg/L、161.31 mg/L和45.62 mg/L，多元統(tǒng)計分析結(jié)果表明與發(fā)酵過程中的β-葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶和果膠酶有關(guān)。一些研究表明β-葡萄糖苷酶和碳水化合物水解酶活性可能參與非芳香族前體的分解以及隨后釋放高級醇[19]。

2.3.3 混合發(fā)酵酶活性與酸類物質(zhì)的相關(guān)性分析

以兩種不同混合發(fā)酵方式中的β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果膠酶的酶活性（AUC值）作為自變量X，以15種酸類物質(zhì)作為因變量Y，建立模型PLSR。對構(gòu)建的PLSR模型提取變量的主成分進行相關(guān)性載荷分析，結(jié)果見圖7。

圖7 酶活性與酸類物質(zhì)的相關(guān)性Fig.7 Correlation between enzyme activity and acids

由圖7可知，β-葡萄糖苷酶與甲酸（D2）、2-丙烯酸（D6）和4-乙酰丁酸（D15）具有極強的相關(guān)性（P＜0.01），與4-羥基丁酸（D4）、2-甲基-2-丙烯酸（D9）、4-乙酰丁酸（D15）相關(guān)性較強（P＜0.05）；2-甲基丁酸（D8）、己酸（D12）與果膠酶具有極強的相關(guān)性（P＜0.01），乙酸（D1）與酸性蛋白酶和果膠酶相關(guān)性極強（P＜0.01）、而α-淀粉酶與酸類組分無明顯相關(guān)性。脂肪酸通常與難聞的氣味（奶酪和酸味）有關(guān)，但也在平衡果酒風味方面起著關(guān)鍵作用，因為它們存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中可以部分阻止相應(yīng)乙酯的水解[20]。本研究統(tǒng)計分析結(jié)果表明，乙酸較其他酸類物質(zhì)含量較高，其中MST2混合發(fā)酵中乙酸含量最高為425.17 mg/L，而MST2中酸性蛋白酶和果膠酶含量相對較高，說明二者之間具有正相關(guān)性，這一點在多變量分析中得到了反映。

2.3.4 混合發(fā)酵酶活性與醛酮類物質(zhì)的相關(guān)性分析

以兩種不同混合發(fā)酵方式中的β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果膠酶的酶活性（AUC值）作為自變量X，以29種醛酮類物質(zhì)作為因變量Y，建立模型PLSR。對構(gòu)建的PLSR模型提取變量的主成分進行相關(guān)性載荷分析，結(jié)果見圖8。

圖8 酶活性與醛酮類物質(zhì)的相關(guān)性Fig.8 Correlation between enzyme activity and aldoketones

由圖8可知，羥基丙酮（E1）、二羥基丙酮（E8）、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-吡喃-4-酮（E10）、5-羥甲基糠醛（E13）、2,4-二羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（E15）、1-（1,3-二氧雜戊環(huán)-2-基）丙酮（E19）、1-羥基-2-丁酮（E26）、3,5-二羥基-2-甲基-吡喃-4-酮（E27）、2-甲基1,3-環(huán)戊二酮（E28）與β-葡萄糖苷酶相關(guān)性極強（P＜0.01），而與2,5-二甲基呋喃-3,4（2H，5H）-二酮（E7）、5-甲基-2-呋喃甲醛（E12）、5-羥甲基二氫呋喃-2-酮（E18）、5,9-二甲基-2-癸酮（E29）相關(guān)性較強（P＜0.05）；酸性蛋白酶和果膠酶均與1-（2-呋喃基）-乙酮（E2）、2-環(huán)己烯-1-酮（E17）、1，4-二氧螺環(huán)[2.4]-5-庚酮（E20）、5-乙基-3-羥基-4-甲基-2（5H）-呋喃酮（E21）、甘油醛（E25）相關(guān)性極強（P＜0.01），3-丁基-2-羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮（E23）只與酸性蛋白酶相關(guān)性極強（P＜0.01），而α-淀粉酶與酸類組分無明顯相關(guān)性。本試驗中混合發(fā)酵后β-葡萄糖苷酶活性的含量顯著提高，而多變量統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明混合發(fā)酵中的醛酮類物質(zhì)含量和酶活性之間存在關(guān)聯(lián)，而醛酮類物質(zhì)的含量變化與相關(guān)分析的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本試驗研究中混合接種非釀酒酵母和釀酒酵母會影響蘋果酒的香氣特征。幾種香氣化合物與酵母酶活性呈正向顯著相關(guān)。此結(jié)果可以為在混合發(fā)酵中使用釀酒酵母作為提高蘋果酒風味復(fù)雜性的發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果有助于更好地理解酵母菌的酶活性對蘋果酒發(fā)酵過程中發(fā)生的化合物轉(zhuǎn)化的影響，而提高對復(fù)雜發(fā)酵條件中微生物相互作用的理解。不同接種方式和發(fā)酵過程中不同發(fā)酵劑之間的相互作用，以及酶活性對香氣化合物的調(diào)控的分子機制需要進一步研究。