實驗室芽孢桿菌菌種庫中高產蛋白酶、糖基轉移酶菌株的測定與篩選

王夢超，鄭宏臣，趙興亞，徐健勇，肖冬光，宋 詼

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.中國科學院天津工業生物技術研究所工業酶國家工程實驗室，天津 300308）

芽孢桿菌是一龐大種群，在自然界中分布范圍廣并且有著較強的繁殖能力以及穩定的理化性質[1]，在科研和生產中應用較廣，具有較高的研究價值。芽孢桿菌產酶種類多，抗逆性強，多數菌株可以分泌胞外酶，并且多為安全性高以及人畜無害的非致病菌[2-3]，所以在食品等行業得到了廣泛的應用[4-5]。截至目前，全球大約有50%的工業酶制劑是由芽孢桿菌產生的[6]，芽孢桿菌是蛋白酶的主要生產菌株[7]，蛋白酶作為用途最為廣泛的工業酶制劑之一[8-10]，在食品、醫藥、環保、釀造和皮革等工業均有廣泛應用[11-14]；除此之外，近年來發現芽孢桿菌中還存在著豐富的糖基轉移酶資源，糖基轉移酶是現階段具有廣泛應用潛力的新型酶[15-17]，目前利用糖基轉移酶合成糖苷類化合物已經取得了一定的研究進展，并且在利用糖基轉移酶合成新型甜味劑方面也具備良好的應用前景，是新酶研究的熱點之一[18]。

綜上，雖然芽孢桿菌具備菌種多樣性和產酶能力高等突出優點，但截至目前其豐富的菌種資源還有待深入開發和研究。本研究對實驗室芽孢桿菌菌種庫中各菌株產蛋白酶、糖基轉移酶及胞外蛋白分泌等特性進行了綜合檢測和評價分析，并從中篩選得到具有開發潛力的蛋白酶和糖基轉移酶高產菌株，對于開發有價值的芽孢桿菌菌種資源及其進一步的應用研究奠定了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 芽孢桿菌菌種

400株芽孢桿菌菌株（按1～400進行編號并保存于本實驗室）：前期從天津大港土壤樣品中分離篩選獲得，形成實驗室小型芽孢桿菌菌種資源庫，供各種用途的芽孢桿菌菌種篩選備用。

1.1.2 試劑

氯化鈉（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；蛋白胨、酵母粉、酪蛋白（均為生化試劑）：上海漢尼生物技術有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphoglucose，UDPG）、甜菊糖、萊鮑迪苷A（均為分析純）：上海畢得醫藥科技有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L；制備固體培養基時添加20 g/L的瓊脂粉，pH7.0。

1.2 儀器與設備

ZQWY-200S全溫培養搖床：天津億諾科學儀器有限公司；Epoch 2TC酶標儀：美國Biotek公司；Microfuge 16離心機：德國Sigma公司；CascadaIII.I純水儀：美國頗爾公司；SPX-150B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；TW2水浴鍋：德國Abo公司；Waters e2695高效液相色譜儀：沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 主要溶劑的配制

0.4mol/L三氯乙酸（trichloroacetic acid solution，TCA）：稱取6.54 g三氯乙酸溶解于蒸餾水中，定容至100 mL。

0.2g/L酪蛋白溶液：稱取2.0 g酪蛋白，加入2～3滴氫氧化鈉溶液潤濕酪蛋白，加入少量對應pH的磷酸鹽緩沖液（中性pH為7.5，堿性pH為9.0），沸水浴5 min后加入相應磷酸鹽緩沖液80 mL左右，攪拌至酪蛋白完全溶解。冷卻到室溫后調節至需要的pH，再用相應磷酸鹽緩沖液定容至100 mL。放入4 ℃冰箱保存，保質期約為7 d。

甜菊糖（100 mmol/L）：80 mg甜菊糖溶于1 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.5）中，于-20 ℃保存，備用。

UDPG（60 mmol/L）：36 mg UDPG溶于1 mL無菌水中，保存于-20 ℃備用，保質期60 d。

1.3.2 菌株培養及胞外發酵液制備

將菌種庫中的菌株由甘油管經劃線活化，共活化成功335株菌株，接單克隆于小試管中（LB培養基）培養9 h后，再接三角瓶進行擴大培養24 h，裝液量為20mL/100 mLLB培養基，37 ℃、220 r/min培養24 h后12 000 r/min離心4 min取上清為粗酶液，于-20 ℃保存備用，保存時間2～3 d。

1.3.3 蛋白酶的檢測及篩選

以酪蛋白為底物測定各菌株胞外發酵液的蛋白酶酶活力，規定在特定條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個活力單位（IU）。本研究對蛋白酶的檢測及篩選以實驗室保存的模式菌株B.subtilis168、B.subtilisWB600、B.subtilisWB800，以及蛋白酶生產菌株1016和B.amyloliquefaciensBAP為對照菌株，參照生產菌株在本篩選體系的產酶水平，確定野生芽孢桿菌胞外產酶大于100 U/mL為相對高產菌株。

測定條件為中性蛋白酶活性在40 ℃、pH 7.5的條件下測定，堿性蛋白酶活性在50 ℃、pH 9.0條件下測定[19]，具體操作如下：

先將酪蛋白溶液放入測定溫度的水浴鍋中，預熱5 min；每株菌酶活的測定都做3個平行實驗，準備4個2 mL EP管，1個標為對照組，剩下3個為實驗組，將4個EP管均加入250 μL粗酶液，置于測定溫度的水浴鍋中（中性蛋白酶40 ℃，堿性蛋白酶50 ℃）預熱2 min。

對照組加入500 μL、0.4 mol/L三氯乙酸（TCA），實驗組加入250 μL2%酪蛋白溶液輕輕混勻，同時置于待測溫度（中性蛋白酶40 ℃，堿性蛋白酶50 ℃）水浴鍋中水浴10 min，待反應即將結束時輕晃混勻。

反應結束后對照組加入250 μL 2%酪蛋白溶液，實驗組加入500 μL 0.4 mol/L三氯乙酸（TCA），混勻后12 000 r/min離心15 min，取200 μL上清于酶標板測OD280nm值。

樣品的酶活力按下式計算：

式中：Y為樣品與對照之間的吸光度差值帶入標準曲線中的酪氨酸含量，μg；4為將250 μL上清酶液換算成1 mL酶液；n為酶液稀釋倍數；反應時間為10 min。

1.3.4 糖基轉移酶的檢測及篩選[20]

利用本實驗室構建的成熟轉化體系進行糖基轉移酶的篩選，以甜菊糖和萊鮑迪苷A各50%的混合物為底物，每個株菌的測定都設一個對照組提前終止反應。

反應體系：粗酶液175 μL、終濃度為60 mmol/L 的UDPG 15 μL、終濃度為100 mmol/L的甜菊糖和萊鮑迪苷A各50%的混合物10 μL，最后于220 r/min、37 ℃反應24 h。

終止反應體系：體積分數60%的甲醇溶液160μL、1mol/L的硫酸溶液16 μL。

反應終止后12 000 r/min離心10 min取上清過膜過濾除菌進行液相定性分析。

色譜條件為Innoval ODS-2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相乙腈∶水=68∶32，V/V；柱溫40℃；流速0.5mL/min；進樣量10 μL；檢測時間10 min；檢測波長210 nm。

樣品的底物轉化率按計算公式如下：

式中：A0為St或Reb A的底物初始濃度，mmol/L；At為St或Reb A反應后剩余濃度，mmol/L。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

發酵液上清經TCA沉淀后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析[21]。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌菌種庫中菌株產蛋白酶的總體情況分析

本研究對菌種庫中活化成功的335株菌株進行了產蛋白酶情況的聚類分析，并以實驗室保存的模式菌株B.subtilis168、B.subtilisWB600、B.subtilisWB800，以及蛋白酶生產菌株1016和B.amyloliquefaciensBAP為對照菌株，對335株菌株進行產蛋白酶的測定與分析，結果見圖1。

圖1 芽孢桿菌菌種庫中菌株產蛋白酶的總體情況分析Fig.1 Analysis of protease-producing characteristics of strains in Bacillus strains library

由圖1可知，芽孢桿菌菌種庫中可產胞外蛋白酶的菌株共計267株，占79.7%，蛋白酶缺陷菌株68株，占比20.3%，由此可知整個芽孢桿菌菌種庫大部分菌株具有產胞外蛋白酶的能力，對于菌種庫中的蛋白酶缺陷菌株同樣具有良好的研究開發前景，應用該類菌株作為表達外源蛋白的宿主菌，可在不影響胞外蛋白分泌表達的情況下避免外源蛋白的降解，從而形成更具潛力的新型外源蛋白表達系統。除此之外，在可產蛋白酶的267株中只產中性蛋白酶菌株50株，占比18.7%，只產堿性蛋白酶菌株82株，占比30.7%，同時產中性和堿性蛋白酶的菌株有135株占比50.6%，可見，產單一蛋白酶的菌株所占比例相對較小，半數以上的菌株可產多種蛋白酶。因此，在本芽孢桿菌菌種庫中篩選不同蛋白酶的高產菌株將具有良好的研究開發前景。

2.2 中性蛋白酶高產菌株的篩選

對185株可產中性蛋白酶的芽孢桿菌菌株，對比發酵24 h后的胞外酶活，得到12株中性蛋白酶高產菌株，分別為388#、304#、81#、295#、94#、71#、88#、366#、21#、270#、206#菌株。具體結果見圖2。

圖2 芽孢桿菌菌種庫中中性蛋白酶高產菌株的胞外酶活Fig.2 Extracellular enzyme activity of high-yield neutral protease strains in Bacillus strains library

由圖2可知，對照菌株復合蛋白酶生產菌株BAP和模式菌株168的胞外中性蛋白酶活力也在100 U/mL以上，同時可以看出菌種庫中篩選到的12株高產菌株均高于菌株168的胞外酶活，10株甚至高于生產菌株BAP，其中388#菌株的胞外中性蛋白酶酶活最高為446.10 U/mL，并且388#菌株的胞外中性蛋白酶酶活是生產菌株BAP的4.0倍，顯示了新中性蛋白酶生產菌株的開發潛力。

2.3 堿性蛋白酶高產菌株的篩選

對217株可產堿性蛋白酶的菌株進行了24 h發酵，對比其胞外酶活，并且以復合蛋白酶生產菌BAP和堿性蛋白酶生產菌株1016為對照菌株，篩選獲得高產堿性蛋白酶的野生芽孢桿菌菌株，結果見圖3。

圖3 芽孢桿菌菌種庫中堿性蛋白酶高產菌株產酶情況Fig.3 Enzyme production of high-yield alkaline protease strains in Bacillus strains library

由圖3可知，芽孢桿菌菌種庫中存在22株堿性蛋白酶高產菌株，分別為235#、304#、303#、295#、276#、305#、108#、360#、197#、382#、106#、321#、39#、78#、116#、70#、223#、41#、358#、234#、280#菌株，并且有19株產酶能力高于對照菌株，其中235#菌株酶活最高達336.76 U/mL，分別是菌株BAP和菌株1016胞外堿性蛋白酶酶活的3.2倍和3.1倍，顯示了開發堿性蛋白酶生產菌株的潛力。另外，304#菌株堿性蛋白酶酶活達322.31 U/mL，在圖2中304#菌株也是中性蛋白酶高產菌株，可見304#菌株是一株產蛋白酶種類豐富的菌株，可作為菌株BAP的替代菌株進行開發，也將具有良好的應用價值。

2.4 產新型糖基轉移酶菌株的篩選

圖4 芽孢桿菌菌種庫中高底物轉化率菌株Fig.4 Strains with high substrate conversion rate in Bacillus strains library

圖5 菌株BAP胞外蛋白催化的糖基轉化結果Fig.5 Results of glycosyl conversion of strain BAP catalyzed by extracellular protein

圖6 菌株114#胞外蛋白催化的糖基轉化結果Fig.6 Results of glycosyl conversion of strain 114# catalyzed by extracellular protein

應用糖基轉移酶合成糖苷類化合物成為當前的一個研究熱點，糖基轉移酶是通過天然產物合成糖苷類化合物的關鍵酶[22]，相關報道證明，甜菊糖經糖基化后產物的甜度都得到了提高[23]。本研究以甜菊苷（St）和萊鮑迪苷A（RA）為底物，對菌種庫中335株菌株的胞外發酵液進行篩選鑒定，得到了12株高底物轉化率的菌株（見圖4），這些菌株的底物轉化率都在50%以上，說明這些菌株的胞外發酵液中具有以St或RA為底物的糖基轉移酶。其中對照菌株BAP胞外酶的催化產物在210 nm處有萊鮑迪苷D（RD）的吸收峰（見圖5），菌種庫中菌株114#的胞外酶催化產物在210 nm處有萊鮑迪苷E（RE）的吸收峰出現（見圖6），表明這兩株菌株至少產生一種糖基轉移酶，可將底物St或RA轉化為特定的產物RD或RE，這在甜味劑研究領域將具有廣泛應用前景，并且芽孢桿菌來源的新型糖基轉移酶在酶的制備成本上將顯示巨大的成本優勢。另外，其他高底物轉化率的菌株，雖然沒有檢測到特定產物，至少說明其胞外具有以St和RA為底物的糖基轉移酶產生，可能受限于本實驗的檢測條件，沒有檢測到產物，但這些菌仍然顯示了新型糖基轉移酶的巨大開發潛力。

2.5 芽孢桿菌菌種庫中菌株胞外蛋白分泌情況分析

本研究對菌種庫中各菌株的胞外蛋白分泌能力進行了逐一測定，經過胞外蛋白濃度及SDS-PAGE的綜合檢測分析，結果見圖7。

圖7 芽孢桿菌菌種庫中菌株胞外蛋白分泌情況Fig.7 Extracellular protein secretion of strains in Bacillus strains library

由圖7可知，在菌種資源庫中發現了87株胞外蛋白分泌能力相對突出的芽孢桿菌菌株，占比僅為26%，可見，并不是所有芽孢桿菌都具有高水平的胞外蛋白分泌能力。其中，在這87株總蛋白分泌能力突出的菌株中有16株菌具有高產特定蛋白的能力（見圖8），其胞外蛋白中有1-2個分泌相對突出的特異蛋白條帶，針對這些特異條帶可做進一步的蛋白鑒定，從而鑒定獲得某種蛋白的高產菌株。結合本研究的高產菌株篩選結果，在這16株菌株中，295#菌為同時高產中性蛋白酶和堿性蛋白酶的菌株，其SDS-PAGE圖中恰好顯示有兩條胞外高分泌水平的蛋白，顯示了進一步研究開發潛力；12#菌和114#菌經前期篩選鑒定為新型糖基轉移酶的高產菌株；237#菌為中性蛋白酶高產菌株；均顯示了良好的研究開發潛力。

圖8 高效分泌特異蛋白的芽孢桿菌胞外蛋白電泳圖Fig.8 Electrophoretogram of extracellular proteins of Bacillus strains with efficiently secretion specific proteins

3 結論

本研究通過對實驗室小型野生芽孢桿菌菌種庫各菌株產酶情況及胞外分泌能力的逐一測定，成功篩選到12株中性蛋白酶高產菌株、22株堿性蛋白酶高產菌株，還有68株蛋白酶缺失菌株，這些結果對于構建高產酶制劑生產菌株或是構建高效表達系統具有重要意義。同時，通過對糖基轉移酶的篩選得到13株高底物轉換率菌株包括有目的產物RE生成的114#菌株和RD生成的BAP菌株，這對于利用生物技術法合成新型甜味劑的研究來說具有一定的意義，也表明這些菌株將在食品市場上有一定的應用前景。可見，本實驗室的小型芽孢桿菌菌種庫具有良好的菌株多樣性，將適合于多種食品酶制劑的篩選和開發。