響應面法優化乳酸菌發酵蘋果漿工藝及其抗氧化活性分析

袁 晶，康三江，宋 娟

（甘肅省農業科學院農產品貯藏加工研究所，甘肅蘭州 730070）

隨著社會發展和生活水平的提高，人們越來越趨于消費綠色新鮮、安全營養、益生健康的功能食品，非酒精發酵果蔬飲品日益受到消費者關注[1]。益生菌是指通過攝入適當的量，對食用者有健康益處的活的微生物[2]，具有抑菌消炎[3]、增強機體免疫力[4]、抗腫瘤[5-6]等功效。目前人們獲取益生菌主要途徑是通過攝入發酵乳制品，SILANIKOVE N等[7]研究發現全球約有75%的人存在乳糖不耐受癥狀，同時乳制品還有膽固醇含量過高、牛奶蛋白過敏等缺陷，很大程度限制了人們獲取益生菌[8]。蘋果營養全面且均衡，富含碳水化合物、有機酸、維生素和礦物質元素等[9]，大量研究表明，蘋果可作為益生菌發酵的良好基質[10-12]。

本研究利用植物乳桿菌發酵蘋果全果漿，充分保留蘋果全果的營養物質，并通過超聲波-酶法的預處理方式，利用酶反應高效且專一的特點，促進大分子果膠、膳食纖維、淀粉等營養物質分解成小分子并溶出[13-16]，最大程度提高蘋果漿生物利用率。在單因素試驗的基礎上，以活菌數和感官評分為響應值，結合響應面法優化蘋果漿發酵工藝條件，通過比較發酵前后抗氧化活性的變化，為開發一種綠色營養、健康保健的發酵蘋果漿提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果：品種為“紅富士”，甘肅省慶陽市；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CICC 21824：中國工業微生物菌種保藏管理中心。

MRS肉湯培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂（生化試劑）：美國Solarbio公司；纖維素酶（20萬U/g）、果膠酶（30萬U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；鐵離子還原能力試劑盒（ferric reducing antioxidant power，FRAP）：蘇州科銘生物技術有限公司；2,2'-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzthiazo-line-6-sulfonic acid），ABTS）檢測試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；UV4802型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；LRH-250型生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；BL-75G型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；SC-298型立式菌種保藏柜：青島海爾股份有限公司；HR2096型飛利浦攪拌機：飛利浦電子（香港）有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；TGL-16MC冷凍離心機：長沙維爾康湘鷹離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取甘油保存的植物乳桿菌菌液于MRS固體培養基上劃線活化，37 ℃恒溫培養24 h后，挑取長勢較好的單菌落接種于MRS液體培養基中擴培，活化1～2次。充分活化后的菌液4 000 r/min離心10 min，取沉淀用生理鹽水（0.9%氯化鈉無菌水溶液）溶解，同時進行菌落計數，備用。

1.3.2 超聲波-酶法預處理蘋果漿

新鮮蘋果清洗后去核、打漿，快速加入0.06%（w/w）Na2SO3攪拌均勻，加入復合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶1，0.07%）后超聲處理（200 W，10 min，55 ℃），置于55 ℃水浴中繼續酶解50 min。酶解結束后，用NaOH溶液（3 mol/L）調整蘋果漿pH為5.0，于121 ℃滅菌10 min[17]迅速冷卻待用。

1.3.3 發酵

將重懸后的植物乳桿菌接入上述蘋果漿中，34 ℃靜置發酵72 h后，得發酵蘋果漿，取樣測定指標。

1.3.4 單因素試驗

設定接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%（V/V），發酵溫度分別為28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃，發酵時間分別為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h，考察接種量、發酵溫度及發酵時間對蘋果漿發酵的影響。

1.3.5 Box-Behnken中心組合試驗設計

為確定蘋果漿最佳發酵工藝參數，依據單因素試驗結果，選擇接種量、發酵溫度、發酵時間為影響因素，以活菌數和感官評分為響應值，根據Box-benhnken中心組合設計原理，運用Design-Expert 8.6.0.1軟件設計響應面試驗，因素與水平見表1。

表1 蘋果漿發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for apple pulp fermentation conditions optimization

1.3.6 測定方法

（1）活菌數、可滴定酸和感官評價測定

活菌數采用GB4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中的傾注平板計數法測定。可滴定酸參照GB 12456—2008《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法測定。

感官評價采用9分制的評分方法[18]，滿分36分。邀請9名具有食品發酵相關專業知識背景的老師對發酵蘋果漿進行感官品評，評分細則詳見表2。

表2 發酵蘋果漿感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented apple pulp

（2）總抗氧化活性測定

鐵離子還原能力、ABTS自由基清除能力的測定均采用試劑盒法。鐵離子還原能力單位為U/mL，ABTS自由基清除能力以1 mL樣品中的Trolox等效抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示，單位為μmol Trolox/mL。

1.3.7 數據統計分析

所有試驗均重復3次，數據處理和顯著性差異分析采用Origin2018和SPSS24.0軟件，實驗設計和數據處理采用Design-Expert 8.0.6.1軟件。

2 結果與分析

2.1 蘋果漿發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 接種量對發酵蘋果漿的影響

圖1 接種量對發酵蘋果漿活菌數、可滴定酸和感官評分的影響Fig.1 Effect of inoculum on viable cell count,titratable acidity and sensory evaluation of fermented apple pulp

如圖1所示，隨著乳酸菌接種量的增加，蘋果漿發酵體系中的活菌數呈現先增加后下降的趨勢。研究表明，接種量過高，發酵速度過快，過酸的環境和生存競爭反而會影響乳酸菌生長[19]，當接種量為10%時，其活菌數達到最大值8.68 lg（CFU/mL）。體系中可滴定酸隨著接種量的增加呈現逐步升高的趨勢，但發酵過快產酸過多會影響感官品評，當接種量為10%時感官評分達到最大值。因此，選擇接種量為8%、10%和12%。

2.1.2 發酵溫度對發酵蘋果漿的影響

圖2 發酵溫度對發酵蘋果漿活菌數、可滴定酸和感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on viable cell count,titratable acidity and sensory evaluation of fermented apple pulp

如圖2所示，隨著發酵溫度的升高，發酵體系的活菌數、可滴定酸和感官評分均呈現先上升后降低的趨勢。31 ℃、34 ℃、37 ℃均適宜乳酸菌發酵，當發酵溫度為34 ℃時，體系中活菌數達到最大值8.65 lg（CFU/mL）。隨著發酵溫度的繼續升高，體系中活菌數、可滴定酸和感官評分均呈現下降趨勢，說明該條件已不適宜乳酸菌生長代謝。因此，選取發酵溫度為31 ℃、34 ℃和37 ℃。

2.1.3 發酵時間對發酵蘋果漿的影響

圖3 發酵時間對發酵蘋果漿活菌數、可滴定酸和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on viable cell count,titratable acidity and sensory evaluation of fermented apple pulp

發酵時間影響乳酸的產量和口感，如圖3所示，隨著發酵時間的延長，發酵體系中的活菌數和感官評分呈現先上升后下降的趨勢，可滴定酸表現為先增加后趨于平緩。在發酵第72小時，發酵體系中活菌數達到最大值8.53lg（CFU/mL），此時感官評分也達到最大值33.01，可滴定酸含量隨著發酵時間的延長而不斷累積增加，但是過量的酸積累會引起過酸的口感。因此，選擇發酵時間為60 h、72 h和84 h。

2.2 蘋果漿發酵工藝優化BBD響應面試驗結果

依據單因素試驗結果，選擇接種量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）為自變量，活菌數（Y1）和感官評分（Y2）為響應值，運用Box-Behnken試驗設計優化蘋果漿發酵工藝，結果見表3。

表3 蘋果漿發酵條件優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface methodology for apple pulp fermentation conditions optimization

利用響應面軟件Design expert 8.0.6.1對表3試驗結果進行多元回歸擬合，獲得響應值活菌數（Y1）和感官評分（Y2）的回歸模型方程式分別為：

對這兩個模型進行回歸與方差分析，結果見表4和表5。

表4 以活菌數為評價指標的回歸模型方差分析結果Table 4 Variance analysis results of regression model using viable cell count as evaluation index

表5 以感官評分為評價指標的回歸模型方差分析結果Table 5 Variance analysis results of regression model using sensory evaluation as evaluation index

由表4可知，模型顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型復相關系數R2為0.9894，校正決定系數R2為0.9758，說明該模型擬合度較高。各因素對發酵蘋果漿中活菌數的影響程度從強到弱依次為：接種量＞發酵時間＞發酵溫度，且結合表中F值可知，接種量（A）、發酵時間（C）、接種量和發酵溫度的交互項（AB）、接種量的二次項（A2）、發酵溫度的二次項（B2）和發酵時間的二次項（C2）為極顯著影響因素（P＜0.01），發酵溫度（B）為顯著影響因素（P＜0.05），其他因素影響較小。

由表5可知，模型顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型復相關系數R2為0.989 0，校正決定系數R2為0.974 7，說明模型擬合度較高。由P值可知，各因素對發酵蘋果漿感官評分的影響程度從強到弱依次為：發酵溫度＞接種量＞發酵時間，且結合表中F值可知，接種量（A）、發酵溫度（B）、接種量和發酵時間的交互項（AC）、發酵溫度和發酵時間的交互項（BC）、接種量的二次項（A2）、發酵溫度的二次項（B2）和發酵時間的二次項（C2）為極顯著影響因素（P＜0.01），其他因素影響較小。

根據回歸方程作各因素對活菌數及感官評分影響的響應面圖，結果見圖4。

圖4 接種量、發酵時間和發酵溫度交互作用對活菌數及感官評分影響的響應面及等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on viable cell count and sensory evaluation

由圖4可知，接種量和發酵溫度對活菌數含量的交互效應極顯著（P＜0.01）。隨著發酵時間的延長，蘋果漿中活菌數呈現先增長后逐漸減少的趨勢，在接種量為9%～10%，發酵時間為66～72 h時，活菌數較大；接種量和發酵時間、發酵溫度和發酵時間對感官評分的交互影響效應極顯著（P＜0.01）。

經過Design-Expert8.0.6.1軟件優化處理后，以活菌數為主要評價指標，得到乳酸菌發酵蘋果漿的最佳工藝條件為：接種量10.08%（V/V），發酵溫度34.43 ℃，發酵時間70.6 h；以感官評分為主要評價指標，得到乳酸菌發酵蘋果漿的最佳工藝條件為：接種量9.79%（V/V），發酵溫度34.75 ℃，發酵時間70.98 h。為保證益生菌發酵蘋果漿最佳活菌數，同時參考感官評分評價指標，將該方案優化修約后，得到乳酸菌發酵最佳工藝條件為：接種量10%（V/V），發酵溫度34 ℃，發酵時間71 h，通過三組平行試驗得到發酵蘋果漿的活菌數為9.01 lg（CFU/mL），感官評分33.91，與模型預測值較為吻合。

2.3 發酵蘋果漿的抗氧化能力

表6 發酵前后蘋果漿的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of apple pulp before and after the fermentation

由表6可知，與未經發酵的蘋果漿相比，發酵后的蘋果漿FRAP鐵離子還原能力、ABTS自由基清除能力顯著提高（P＜0.05）。葉盼等[20]利用植物乳桿菌發酵蘋果汁，發酵后的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和ABTS自由基清除能力顯著增強，發酵后的蘋果汁抗氧化性能得到提高。這可能是因為乳酸菌在發酵過程中產生了水解酶，使部分結合態多酚水解成游離酚，并且高酸環境阻止了酚類物質的降解，從而提高了發酵后果汁的抗氧化活性。

3 結論

本研究以蘋果漿為原料，結合乳酸菌發酵蘋果漿，在單因素試驗的基礎上，以活菌數和感官評分為響應值優化蘋果漿發酵工藝參數。確定乳酸菌發酵蘋果漿最佳工藝條件為：接種量10%，發酵溫度35 ℃，發酵時間71 h。在此優化條件下，發酵蘋果漿的活菌數實際值為9.01 lg（CFU/mL），感官評分實際值為34分。與未經發酵的蘋果漿相比，發酵后的蘋果漿FRAP鐵離子還原能力、ABTS自由基清除能力分別提高了5.78%和18.41%，說明乳酸菌發酵蘋果漿可有效提高產品的抗氧化活性。該研究為開發一種綠色營養、益生健康的發酵蘋果漿提供理論依據。