均勻設計優(yōu)化生香酵母產(chǎn)酯發(fā)酵工藝

成 福，肖 洋，王 婷，曹武龍，張秋寒，唐一山，王萬能

（重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054）

生香酵母又名產(chǎn)酯酵母，主要是假絲酵母屬（Candida）和漢遜酵母屬（Hansenula），在白酒生產(chǎn)中漢遜酵母應用最多[1]。生香酵母在白酒釀造中主要產(chǎn)生乙酸乙酯以增酯提香[2-3]，其代謝產(chǎn)物中的醇類、酸類、羰基化合物等物質(zhì)對于協(xié)調(diào)酒體味道也有重要作用[4-5]。生香酵母發(fā)酵過程中水解和酯化反應有助于協(xié)調(diào)酒液中的酸、醇和酯水平[6]，有利于維持酒體中物質(zhì)的平衡。

清香型白酒以乙酸乙酯為主體香，其口味清香、醇厚，但我國清香型白酒的生產(chǎn)是以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、根霉（Rhizopus）等為主體進行發(fā)酵，酒液中酯類含量較低，需要提高酒體口味和品質(zhì)[7]。液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)白酒是我國生產(chǎn)白酒的組成部分，楊強等[8]從酒曲中通過液態(tài)發(fā)酵法分離出一株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌種Y29，較對照的乙酸乙酯產(chǎn)量顯著提高，且出酒率等未受影響。液態(tài)發(fā)酵釀酒技術(shù)具有工藝簡單、出酒率高、成本低等優(yōu)點，但酒的品質(zhì)差[9]，因此，探究生香酵母發(fā)酵產(chǎn)酯代謝特點，將其應用于高品質(zhì)的清香型白酒的生產(chǎn)有重要意義。

目前，針對生香酵母的產(chǎn)酯工藝優(yōu)化大多是從發(fā)酵糖度、溶液酸堿度、溫度等方面進行優(yōu)化[10-12]，對于生香酵母菌株的生長情況以及產(chǎn)酯發(fā)酵過程中的調(diào)控考慮較少，對于生香酵母產(chǎn)酯工藝的過程仍需調(diào)整優(yōu)化。因此，本研究通過均勻試驗設計優(yōu)化生香酵母產(chǎn)酯工藝，針對生香酵母產(chǎn)酯的過程進行分階段調(diào)控，確定生香酵母產(chǎn)酯代謝各階段的時間，優(yōu)化出最佳的生香酵母產(chǎn)酯工藝，為生產(chǎn)高質(zhì)量的清香型白酒提供思路，為提高液態(tài)發(fā)酵白酒的品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種漢遜酵母屬（Hansenula）生香酵母H1：分離自安琪生香酵母酒曲，實驗室保藏。

1.1.2 試劑

鹽酸羥胺、氫氧化鈉、乙酸乙酯（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；無水乙醇（分析純）：重慶川東化工有限公司；酚酞指示劑：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g、酵母膏10.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 L，pH為6.0，115 ℃高壓濕熱滅菌15 min。YEPD液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：葡萄糖161 g、酵母膏0.10 g、磷酸二氫鉀0.10 g、磷酸氫二銨0.25 g，氯化鎂0.10 g，5.0%豆芽汁1 L，pH為5.0，115 ℃高壓濕熱滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

L-550臺式離心機、TGL-16M高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機有限公司；ZHWY-2102C振蕩培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；BSP-100生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FE20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-2450分光光度儀：島津國際貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝

根據(jù)生香酵母產(chǎn)酯代謝特點[13-14]，其產(chǎn)酯過程可概括為酵母生長階段、乙醇發(fā)酵階段、產(chǎn)酯階段，本研究通過此三階段對生香酵母產(chǎn)酯工藝進行優(yōu)化。取適量菌液劃線于YEPD瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種于200 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)36 h，制備種子液。按10%（V/V）的接種量將種子液接種于產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為100 mL/250 mL，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，設置三組平行試驗。按照均勻試驗設計表進行試驗。如第1組，接種培養(yǎng)4 h后取出錐形瓶，進行密封，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，進入乙醇發(fā)酵階段。發(fā)酵72 h之后，解除密封狀態(tài)，進入產(chǎn)酯發(fā)酵階段。發(fā)酵88 h后取出發(fā)酵瓶，測定總酯和乙酸乙酯含量。

1.3.2 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗設計

以總酯含量（Y1）和乙酸乙酯含量（Y2）為評價指標，選取菌株生長時間（A）、乙醇發(fā)酵時間（B）、產(chǎn)酯發(fā)酵時間（C）為考察因素，進行3因素13水平的均勻設計優(yōu)化試驗，因素與水平見表1[15]。

表1 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of uniform test design for ester production process optimization of aroma-producing yeast H1

1.3.3 測定方法

總酸、總酯含量的測定：參照國標GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[16]。

乙酸乙酯含量的測定[17]：乙酸乙酯可以與鹽酸羥胺乙醇溶液及三氯化鐵反應，生成一種洋紅色的絡合物，這種洋紅色的絡合物在波長530 nm處有特征吸收峰，采用紫外-可見光分光光度計對其含量進行測定。

1.3.4 均勻試驗設計數(shù)學建模

對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，采用逐步遞進回歸分析法[18]建立發(fā)酵液中總酯含量、乙酸乙酯含量與酵母生長時間、乙醇發(fā)酵時間、產(chǎn)酯發(fā)酵時間的數(shù)學模型，采用網(wǎng)格法[19]對生香酵母H1發(fā)酵液中的總酯含量、乙酸乙酯含量的回歸方程擬定出最優(yōu)組合。

1.3.5 驗證試驗

對回歸分析優(yōu)化后的結(jié)果進行驗證，并與模擬結(jié)果進行比對分析，確定生香酵母產(chǎn)酯發(fā)酵的最優(yōu)生產(chǎn)工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗設計與結(jié)果

表2 生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝優(yōu)化均勻試驗設計與結(jié)果Table 2 Design and results of uniform test for ester production process optimization of aroma-producing yeast H1

續(xù)表

生香酵母代謝復雜，與發(fā)酵培養(yǎng)時間、溫度、供氧情況等多種因素相關(guān)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，溫度可以影響氧氣和二氧化碳的溶解度，進而對酵母代謝產(chǎn)生影響[21]，過高的溫度會積累較多的乙醇，產(chǎn)生細胞毒性[22]。因此，本研究在28 ℃條件下研究生香酵母H1產(chǎn)酯發(fā)酵工藝條件[23]，利用均勻試驗設計對生香酵母H1發(fā)酵產(chǎn)酯工藝進行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

由表2可知，乙酸乙酯含量和總酯含量變化趨勢相同，且每組試驗中乙酸乙酯含量均高于總酯含量的60%，說明生香酵母H1主要產(chǎn)生乙酸乙酯，為其在生產(chǎn)清香型白酒中的應用奠定基礎。當總酯含量達到最大值（2.090 g/L）時，發(fā)酵液中的總酸含量達到最低值（1.680 g/L），總酸含量與酯類物質(zhì)的含量呈現(xiàn)相反的變化趨勢，表明發(fā)酵液中酸參與了生香酵母的產(chǎn)酯代謝過程，并作為合成酯的前體物質(zhì)被發(fā)酵利用。

酵母生長時間不足會影響酵母代謝產(chǎn)物的積累，影響白酒的質(zhì)量。由表2可知，當酵母生長時間僅為4 h 時，總酯含量為1.085 g/L，總酸的含量較高為2.437 g/L。由于酵母在發(fā)酵初期需要生長積累數(shù)量，為后續(xù)發(fā)酵保證有足夠數(shù)量的“發(fā)酵工廠”，因此，當酵母的生長時間過短時，對于酸的利用較少，總酯的積累受到限制。發(fā)酵過程中的酯類物質(zhì)含量受乙醇發(fā)酵時間的影響較大，乙醇發(fā)酵階段過長，乙醇過多產(chǎn)生可能導致細胞毒性，影響酯的積累，如乙醇發(fā)酵時間為104 h時，總酯含量（1.399 g/L）比乙醇發(fā)酵時間為64 h的總酯含量（2.090 g/L）低，表明需要合理控制乙醇發(fā)酵時間，并對該階段工藝進行優(yōu)化。此外，產(chǎn)酯時間也是影響酯積累的重要因素。當產(chǎn)酯發(fā)酵時間為8 h時，總酯含量僅為0.554 g/L。但如果菌體數(shù)量積累過大，發(fā)酵時間過長，也會導致營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，產(chǎn)酯量降低[24]，如當發(fā)酵產(chǎn)酯時間為104 h時，其總酯含量僅為1.187 g/L，提示在生產(chǎn)工藝的控制中，需要選擇合適產(chǎn)酯發(fā)酵時間，以保證白酒的生產(chǎn)質(zhì)量。此外，結(jié)果顯示，總酯及乙酸乙酯含量最高的一組（4號），其產(chǎn)酯發(fā)酵時間僅為16 h，表明酵母產(chǎn)酯發(fā)酵時間是影響酵母產(chǎn)酯的重要因素，需要進行優(yōu)化。在酒液中，酸、醇、酯等物質(zhì)對于白酒口味的協(xié)調(diào)非常重要，因此，本研究針對酵母生長時間、乙醇發(fā)酵時間、產(chǎn)酯發(fā)酵時間三個階段進行優(yōu)化合理，利于提高白酒的質(zhì)量，有助于白酒釀造工藝的發(fā)展。

2.2 均勻試驗設計數(shù)學建模回歸分析

2.2.1 總酯含量模型回歸分析

通過均勻試驗設計軟件對表2總酯含量的試驗數(shù)據(jù)進行分析，采用逐步遞進法回歸分析后得到了發(fā)酵液中總酯含量（Y1）與生香酵母的生長時間（A）、乙醇發(fā)酵時間（B）、產(chǎn)酯發(fā)酵時間（C）的數(shù)學模型：

采用網(wǎng)格法對發(fā)酵過程中總酯的回歸方程搜索最優(yōu)化組合，結(jié)果表明，當生香酵母H1的生長時間為18 h，乙醇發(fā)酵時間為74 h，產(chǎn)酯發(fā)酵時間為20 h時，預期最優(yōu)總酯含量可達到2.260 g/L，顯著性水平α=0.100 0；剩余標準差s=0.084 7；復相關(guān)系數(shù)R2=0.996 7；決定系數(shù)R2=0.993 3。

2.2.2 乙酸乙酯含量模型回歸分析

發(fā)酵液中乙酸乙酯含量變化趨勢和總酯含量變化趨勢相同，因此，對于總酯和乙酸乙酯的數(shù)學模型的優(yōu)化結(jié)果較一致，通過均勻試驗設計軟件對表2中乙酸乙酯含量的試驗數(shù)據(jù)進行分析，采用逐步遞進法回歸分析后得到了發(fā)酵液中乙酸乙酯含量（Y2）與生香酵母生長時間（A）、乙醇發(fā)酵時間（B）、產(chǎn)酯發(fā)酵時間（C）的數(shù)學模型：

采用網(wǎng)格法對發(fā)酵產(chǎn)生乙酸乙酯的回歸方程搜索最優(yōu)化組合，結(jié)果表明，當酵母菌體生長時間為16 h，乙醇發(fā)酵時間為69 h，產(chǎn)酯發(fā)酵時間為18 h時，預期最優(yōu)乙酸乙酯含量可達到1.933 g/L，顯著性水平α=0.100 0；剩余標準差s=0.078 8；復相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6；決定系數(shù)R2=0.993 1。

2.2.3 驗證試驗

總酯中含量最多的為乙酸乙酯，因此，在進行驗證試驗時根據(jù)總酯含量的數(shù)學模型優(yōu)化結(jié)果進行驗證試驗，對發(fā)酵液中總酯、乙酸乙酯含量進行分析。結(jié)果表明，當生香酵母H1生長時間為18 h、乙醇發(fā)酵時間為74 h、產(chǎn)酯發(fā)酵時間為20 h時，發(fā)酵液中最終的總酯含量可達2.463 g/L，比預期試驗結(jié)果（2.260 g/L）提高8.980%；乙酸乙酯含量為2.164 g/L，比預期試驗結(jié)果（1.933 g/L）提高11.95%。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝下，發(fā)酵液中總酯及乙酸乙酯含量均高于表2中4號試驗組。因此，確定生香酵母H1產(chǎn)酯的最優(yōu)發(fā)酵工藝為菌株生長時間18 h、乙醇發(fā)酵時間74 h、產(chǎn)酯發(fā)酵時間20 h。優(yōu)化后的生香酵母H1的生長時間為18 h，此時的酵母細胞新陳代謝旺盛，對環(huán)境變化適應能力強，酵母細胞積累適量，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)充裕，此時進入乙醇發(fā)酵階段，充裕的營養(yǎng)物質(zhì)可以為乙醇的積累提供保障。總酯模型中含有乙醇發(fā)酵時間（B）的優(yōu)化項較多，表明乙醇發(fā)酵時間是影響生香酵母產(chǎn)酯發(fā)酵的重要因素。生香酵母乙醇發(fā)酵能力大多較釀造型酵母低，可能需要花費較長的時間進行乙醇的積累，而乙醇作為酯類物質(zhì)合成的重要物質(zhì)，乙醇的積累對于總酯、乙酸乙酯的積累量有重要的作用。優(yōu)化后的乙醇發(fā)酵時間為74 h，符合實際，優(yōu)化合理。產(chǎn)酯發(fā)酵階段是利用前期積累的前提物質(zhì)進行酯類物質(zhì)的合成，但如果產(chǎn)酯時間過長，產(chǎn)酯的前體物質(zhì)消耗殆盡，總酯不再積累，甚至伴隨著氧氣供給酯酶活力恢復，導致發(fā)酵液總酯含量下降，符合優(yōu)化目的。驗證試驗結(jié)果表明優(yōu)化后的工藝符合并優(yōu)于預期試驗結(jié)果，表明數(shù)學模型建立成功，優(yōu)化后的工藝組合可靠，達到實驗目的。

3 結(jié)論

以生香酵母菌種H1進行產(chǎn)酯發(fā)酵研究，通過均勻試驗設計優(yōu)化、數(shù)學建模回歸分析后確定其產(chǎn)酯最優(yōu)發(fā)酵工藝為菌株生長時間18 h，乙醇發(fā)酵時間74 h，產(chǎn)酯發(fā)酵時間20 h。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝下，發(fā)酵液中總酯含量為2.463 g/L，乙酸乙酯含量為2.164 g/L，與預期結(jié)果相符，表明數(shù)學模型建立可靠、數(shù)據(jù)可信度高。優(yōu)化生香酵母產(chǎn)酯發(fā)酵條件，對于提高白酒品質(zhì)有重要意義，也為液態(tài)發(fā)酵釀酒技術(shù)提供了參考，具有較高的應用價值。