貴州泡菜中乳酸菌的分離鑒定及其在泡菜發酵中的應用

趙山山，楊園園，周玉巖，劉貴巧，郝光飛

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038；2.河北省藥品檢驗研究院，河北石家莊 050011）

泡菜又稱為腌漬菜，是利用新鮮蔬菜為原料添加八角、花椒、鹽等輔料，經乳酸菌為主的多種微生物發酵制成的傳統美食。蔬菜經過乳酸菌主導的厭氧發酵改善了蔬菜的風味，延長了蔬菜的貯藏期[1-2]。發酵過程中還產生了醇、醛、酮、烯和酯等風味物質，賦予了泡菜獨特的風味[3]。泡菜中除了蔬菜中的營養成分外，還有發酵過程乳酸菌產生的有機酸和蛋白酶等物質，具有促進腸道蠕動，幫助人體消化，降低膽固醇，以及調節生理機能等保健功效[4-6]。泡菜以其獨特風味和多種保健功效成為人們餐桌上必不可少的菜肴。

傳統自然發酵方式發酵周期相對較長，生產效率低，食品安全問題難控制，難以實現大規模的工業化生產。針對這些問題國內外研究者對泡菜發酵過程中起主要作用的微生物菌群進行了研究。葉陵等[7]研究發現，乳桿菌屬（Lactobacillus）是促使泡菜發酵成熟的主要菌群，主要包括植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）等。研究學者從發酵食品中分離得到具有不同發酵性能的菌株，如高產酸菌株[8]、耐鹽菌株[9]和降解亞硝酸鹽的乳酸菌[10]。其中高產酸、耐酸的乳桿菌能夠控制泡菜發酵的周期，加速發酵蔬菜的快速成熟[11-12]。除此之外，還分離得到一些拮抗性乳酸菌，對大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等有較強的抑制作用[13-14]。但是具有益生功能的乳酸菌多從酸奶中篩選得到，發酵泡菜中的篩選相對較少[15]。李清等[16]從貴州劍河采集的傳統自然發酵豆醬中分離篩選的植物乳桿菌DJ-04對人工胃腸液表現出良好的耐受性，具有腸道益生菌的潛能。吳偉杰等[17]將分離獲得的乳酸腸球菌（Enterococcusfaecium）WJ03接種發酵蘿卜泡菜后，縮短了泡菜的發酵周期，改善了泡菜風味。由此可見，發酵蔬菜是潛在的優質乳酸菌的自然資源庫，為制備不同種類的乳酸菌發酵劑提供了選擇。

本研究從貴州遵義市采取的泡菜中分離篩選高產酸乳酸菌，通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行鑒定，并探究其耐酸、耐膽鹽性能、抑菌性能和耐鹽性能，獲得具有多種優良性能的乳酸菌。最后，將篩選得到的優良乳酸菌應用到泡菜中，分析對比自然發酵泡菜和接種乳酸菌泡菜的各項指標，為泡菜的工業化生產和發酵劑的制備提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料泡菜樣品：從貴州遵義市采集11份不同家庭制作的發酵泡菜；新鮮白蘿卜：貴州農家。

1.1.2 菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 8739、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538：美國菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC）；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ST-III：河北工程大學生命科學與食品工程學院微生物資源與利用實驗室保藏。

1.1.3 試劑

氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司；牛膽鹽（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.4 培養基

MRS液體培養基、MRS固體培養基、明膠液化培養基、接觸酶試驗培養基、H2S產生試驗培養基、硝酸鹽還原試驗培養基：國藥集團化學試劑有限公司；糖發酵培養基：上海晶純試劑有限公司；營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；LB培養基：上海博微生物科技有限公司；CaCO3-MRS固體培養基：在MRS固體培養基中加入1.5%的碳酸鈣。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱、DHP-9162電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；Microfuge 20高速離心機：美國貝克曼庫爾特公司；T100 Thermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、Power pac2000電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；JTNJB牛津杯（內徑為6.0 mm）：北京吉泰遠成科技有限公司；ZHPW-70臺式振蕩培養箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；UV1901紫外可見分光光度計：杭州艾普儀器設備有限公司；OPTEC雙目生物顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離

在無菌條件下取樣品中泡菜汁，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋。選取稀釋度為10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋液1 mL于無菌培養皿中，用CaCO3-MRS固體培養基澆注混勻，凝固后37 ℃恒溫倒置培養48 h[18]。挑取有明顯溶鈣圈，且溶鈣圈較大的單菌落進行平板劃線，37 ℃培養48 h，反復純化多次。將純化得到的單菌落接種到MRS肉湯培養基培養，所得菌液加入30%的甘油中在-20 ℃保存。

1.3.2 高產酸乳酸菌的篩選

將分離純化的菌株接種于MRS液體培養基中，37 ℃厭氧培養24 h，參照文獻[19]測定產酸量，選取產酸能力較高的菌株進行菌種鑒定。

1.3.3 乳酸菌的鑒定

形態觀察：挑選篩選菌株的單菌落接種于MRS固體培養基，37 ℃條件下培養24 h，觀察單菌落的色澤、形態、大小，并進行鏡檢，觀察菌株的細胞形態。

生理生化實驗：將篩選菌株進行革蘭氏染色及過氧化氫酶實驗，篩選出革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株進行硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗、硫化氫實驗和糖發酵實驗[18]，參照《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）[20]、《乳酸菌細菌的分類鑒定與實驗方法》[18]對菌種進行綜合判定。

分子生物學鑒定：提取篩選乳酸菌的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用16S rDNA的通用引物27F（5'-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3'）、1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系：DNA模板1 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，雙蒸水（ddH2O）7 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃末端延伸5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取在1 500 bp左右的PCR擴增產物送至上海生物工程有限責任公司進行測序。DNA編碼用DNA star軟件中的Seq Man II進行序列拼接、校對；將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數據中進行局部序列比對基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA5軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構建系統發育樹[21]。

1.3.4 乳酸菌種子液的制備

將-80 ℃保藏的甘油管菌液37 ℃水浴，直至全部溶解。采用接種環沾取少量菌液，在MRS固體平板上劃線，37 ℃倒置培養至長出單菌落。挑取單菌落接種到MRS液體培養基，37 ℃靜置培養12 h后，連續轉接3次，將菌液的菌體濃度調整至1×108CFU/mL作為種子液備用。

1.3.5 乳酸菌耐酸能力的測定

以3%（V/V）的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養基中，37℃條件下靜置培養12h。將菌懸液在10000r/min條件下離心1 min，棄上清液，用無菌生理鹽水清洗菌體3次。用pH 2.0的鹽酸水溶液重懸菌體，酸處理2 h后進行10倍梯度稀釋，選取合適稀釋度的稀釋液，采用MRS固體培養基平板澆注法在37 ℃條件下培養48 h后，采用平板菌落計數法計算菌落數，并計算乳酸菌的存活率[22]。同時以未經酸處理的菌株作為對照，每個實驗重復3次，每株菌每次實驗做3個平行。乳酸菌耐酸存活率計算公式如下：

式中：N2為酸耐受2 h的活菌數，CFU/mL；N1為酸耐受前的活菌數，CFU/mL。

1.3.6 乳酸菌耐膽鹽能力的測定

以3%（V/V）的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養基中，37℃條件下靜置培養12h。將菌懸液在10000r/min條件下離心1 min，棄上清液，用無菌生理鹽水清洗菌體3次。用0.3%的無菌膽鹽水重懸菌體，處理2 h后進行10倍梯度稀釋，選取合適稀釋度的稀釋液，采用MRS固體培養基平板澆注法在37 ℃條件下培養48 h后，采用平板菌落計數法計算菌落數，并計算乳酸菌的存活率[22]。同時以未經膽鹽處理的菌株作為對照，每個實驗重復3次，每株菌每次實驗做3個平行。乳酸菌耐膽鹽存活率計算公式如下：

式中：N2為膽鹽耐受2 h的活菌數，CFU/mL；N1為膽鹽耐受前的活菌數，CFU/mL。

1.3.7 乳酸菌抑菌能力的測定

（1）指示菌株的活化

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別劃線于營養瓊脂培養基，37 ℃條件下培養48 h。然后挑取單菌落接種于營養肉湯培養基中，37 ℃、180 r/min條件下培養24 h。調整菌體濃度為1×107CFU/mL作為指示菌懸液。

（2）乳酸菌菌株上清液的制備

4)注意作為修正標記語的well，如果well處于話輪的中間，則為自己修正標記語；而處于話輪開始時，則為他人修正標記語。

以3%（V/V）的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養基，37 ℃條件下靜置培養12 h，10 000 r/min離心2 min后取上清液，4 ℃保存備用。

（3）牛津杯法測定抑菌性能[23]

向培養皿中傾注10 mL滅菌后的0.5%～0.8%營養瓊脂培養基，水平靜置凝固，接種100 μL指示菌菌液，涂布均勻后備用。用鑷子將牛津杯垂直培養基表面均勻放置，牛津杯中加入100 μL乳酸菌上清液。4 ℃擴散2 h，37 ℃恒溫培養24 h。用游標卡尺，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑大小判斷菌株抑菌性能。抑菌圈直徑＞7 mm時，判定為有抑菌作用。

1.3.8 乳酸菌的耐鹽性能測定

初篩：以2%（V/V）的接種量將乳酸菌種子液接種于鹽含量為8%的MRS液體培養基中，37 ℃條件下靜置培養24 h，測定OD600nm值。觀察各個菌株的生長情況。

復篩：將篩選出的菌株以2%（V/V）的接種量將種子液分別接種于鹽含量為0、8%的MRS液體培養基中，37 ℃條件下靜置培養，每2 h取樣，測定OD600nm值[24]。用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ST-III作為對照組。每個實驗重復3次，做3個平行。

1.3.9 優良乳酸菌發酵泡菜的制備及指標測定

（1）發酵泡菜的制備

人工接種組：將性能優良的乳酸菌接種于MRS液體培養基，37 ℃條件下靜置培養24 h，5 000 r/min離心2 min，用無菌生理鹽水將菌體沖洗干凈。調整菌體濃度為1×108CFU/mL，菌種接種量為0、2%、4%、6%，加入與自然發酵組工藝相同的泡菜中，密封常溫發酵。每3 d取樣進行感官評價和pH值的測定。

（2）泡菜質量指標的測定

pH值的測定：采用pH計測定發酵后泡菜汁的pH值。

感官評價[25]：選取15名專業人員對自然發酵的泡菜和人工接種泡菜進行感官評價，滿分9分，具體評分標準見表1。

表1 泡菜感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of pickles

2 結果與分析

2.1 高產酸乳酸菌的篩選

從貴州泡菜樣品中共分離出143株乳酸菌，根據在CaCO3-MRS固體培養基上形成透明的溶鈣圈越大則產酸能力越強[7]，挑選出11株產酸能力較強的菌株，其溶鈣圈直徑和產酸量見表2。

表2 篩選菌株的產酸能力Table 2 Acid-producing ability of screened lactic acid bacteria

由表2可知，菌株A50f7、A50b9、A50c2和A50b2產生的溶鈣圈顯著大于其他菌株（P＜0.05），初步確定這4株菌產酸能力較強。根據菌株產酸量可以得出菌株A50f7、A50b9、A50c2和A50b2的產酸量顯著高于其他菌株（P＜0.05）。其中菌株A50f7、A50b9產酸量最高，分別為3.83 g/L和2.97 g/L。因此，確定菌株A50f7和A50b9為高產酸乳酸菌。

2.2 乳酸菌的鑒定結果

2.2.1 形態學鑒定

11株產酸能力較高的菌株的形態觀察結果見表3。由表3可知，11株乳酸菌的菌落均為白色或乳白色，細胞均呈桿狀，且均為革蘭氏染色陽性菌（G+）。

表3 不同菌株的形態學特征Table 3 Morphological characteristics of different strains

2.2.2 生理生化鑒定

根據《伯杰細菌鑒定手冊》[20]和《乳酸菌細菌的分類鑒定與實驗方法》[18]，這11株菌株的發酵特征與植物乳桿菌一致，可以利用葡萄糖發酵，不運動、不產生吲哚、不液化明膠、不產生H2S、不還原硝酸鹽，可以發酵苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、核糖、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、海藻糖和木糖。結合菌株形態學鑒定結果可以初步鑒定這11株菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.2.3 分子生物學鑒定[26]

11株乳酸菌的系統發育樹見圖1。由圖1可知，菌株A50a8、A50b9、A50b11、A50c2、A50c3與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ST-III（GenBank登陸號：FJ423546）聚于一支，親緣關系最近，因此，將這5株菌鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。菌株A50e2、A50f7、A50f2、A50b2、A50f1、A50e1與副植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）BIM B-535（GenBank登錄號：JF965381.1）聚于一支，親緣關系最近，因此，將這6株菌株鑒定為副植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）。

圖1 基于16S rDNA基因序列11株菌株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 11 strains based on 16S rDNA genes sequences

2.3 乳酸菌耐酸能力的測定

人的胃液pH值在1.5～4.5之間，其pH值的大小因食物結構不同而波動。乳酸菌能夠耐受胃液中高酸性環境，才能進入到腸道中定殖。因此，菌株需對酸性環境具有一定耐受能力。分離篩選得到的11株乳酸菌，在pH 2.0條件下處理2 h，其耐酸能力見表4。

表4 不同乳酸菌的酸耐受能力Table 4 Acid tolerance of different lactic acid bacteria strains

由表4可知，11株乳酸菌經過pH 2.0的酸溶液處理2 h后均能存活，存活率均達到87%以上，說明這11株乳酸菌均具有良好的耐酸性能。其中，菌株A50f7和A50b9的存活率較高，活菌數達到了108CFU/mL以上，耐酸存活率分別為（99.19±0.39）%和（98.17±0.06）%。因此，菌株A50f7、A50b9可以作為具有潛在益生特性的耐酸乳酸菌菌株。

2.4 乳酸菌耐膽鹽能力的測定

人體的腸道環境膽鹽濃度通常為0.03%～0.30%，因此菌株進入腸道定殖，并能發揮益生功能，必須對膽鹽有一定耐受能力。菌株經過0.30%的膽鹽溶液處理2 h后，11株乳酸菌的耐膽鹽能力見表5。

表5 不同乳酸菌的膽鹽耐受能力Table 5 Bile salt tolerance of different lactic acid bacteria strains

由表5可知，11株乳酸菌表現出不同的耐膽鹽能力。其中，菌株A50b9、A50e2、A50c3、A50a8、A50f7的耐膽鹽能力較好，存活率均在70%以上。0.3%的膽鹽溶液處理2 h后其中菌株A50f7、A50b9的活菌數達到了107CFU/mL以上，存活率分別為（85.36±0.78）%和（81.98±0.55）%。

2.5 乳酸菌抑菌能力的測定

蔬菜表面附著的大量微生物中含有大量的腐敗菌和致病菌，使食品的安全性受到影響。乳酸菌在代謝過程中可以產生具有高效、無毒、耐高溫、無殘留、無抗藥性等特點的乳酸菌細菌素，對細菌、真菌，甚至病毒均有抑制作用[27]，對泡菜具有防腐保鮮的作用。本研究利用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，研究11株乳酸菌的抑菌能力，結果見表6。

表6 不同乳酸菌的抑菌能力Table 6 Bactericidal capacity of different lactic acid bacteria strains

由表6可知，11株乳酸菌對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。其中，菌株A50f7和A50b9的抑菌能力顯著高于其他菌株（P＜0.05），對大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為（15.49±0.65）mm和（13.62±1.13）mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別是（14.89±0.34）mm、（14.02±0.67）mm。結果表明，菌株A50f7、A50b9對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用。

2.6 乳酸菌耐鹽性能的測定

乳酸菌的耐鹽能力是用于制作泡菜的重要指標[28]。研究表明，高濃度的鹽會導致細胞內水分外流，細胞胞質分離，最終致使細胞停止生長，甚至死亡[29]。泡菜中鹽濃度過高會延長泡菜的發酵周期，間接影響泡菜的風味[30]。但一定的鹽濃度可以抑制腐敗微生物的生長，防止泡菜腐爛變質。初篩結果顯示，11株乳酸菌菌在含有8%NaCl的MRS液體培養基中培養24 h后，菌株A50f7、A50b2、A50b9、A50b11、A50c2生長情況較好，將這5株乳酸菌進行復篩，復篩結果見圖2。

圖2 在無NaCl（a）及8%NaCl含量（b）條件下5株乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of 5 lactic acid bacteria strains without NaCl (a)and with 8% NaCl (b)

由圖2a可知，在不含NaCl的培養基中，6株乳酸菌培養2 h后進入對數期，乳酸菌A50f7、A50b9、ST-III培養12 h時進入穩定期，乳酸菌A50b2、A50b11、A50c2延滯期較長，生長較為緩慢，培養14 h時進入穩定期。

由圖2b可知，6株乳酸菌在含有8%NaCl的MRS液體培養基中生長時均受到抑制，乳酸菌A50f7、A50b9、ST-III生長速度顯著高于其他菌株，且生長曲線相似，培養10 h時開始進入對數期，26 h時進入穩定期。乳酸菌A50b2、A50b11、A50c2延滯期較長，14 h時開始進入對數期，培養28 h時進入穩定期。綜合以上實驗結果，選取乳酸菌A50f7、A50b9進行泡菜發酵實驗。

2.7 乳酸菌發酵泡菜結果分析

乳酸菌發酵蔬菜過程中產生大量的酸能快速降低泡菜pH值，抑制腐敗菌生長，防止泡菜腐敗變質，延長泡菜保質期，并能促進泡菜色澤的形成，加快泡菜發酵，縮短泡菜發酵周期。乳酸菌A50f7和A50b9的不同接種量對發酵泡菜pH值的影響結果見圖3，不同接種量發酵的泡菜的感官評價結果見表7。

由圖3可知，發酵0～3 d發酵體系的pH值下降較為明顯，且下降速度為乳酸菌A50f7＞乳酸菌A50b9＞自然發酵；發酵12～15 d發酵體系的pH值下降速度趨于平緩，泡菜發酵成熟，發酵成熟所需時間為乳酸菌A50f7＜乳酸菌A50b9＜自然發酵。說明人工接種乳酸菌縮短了發酵泡菜達到泡菜所需pH值的發酵時間，提高了發酵泡菜的生產率。

圖3 乳酸菌A50b9（a）及A50f7（b）不同接種量對發酵泡菜pH值的影響Fig.3 Effect of different inoculum of lactic acid bacteria A50b9 (a) and A50f7 (b) on pH value of fermented pickle

表7 不同接種量乳酸菌發酵的泡菜的感官評價結果Table 7 Sensory evaluation results of pickles fermented by lactic acid bacteria with different inoculum

由表7可知，綜合色澤、氣味、滋味、脆度評分，當乳酸菌接種量為4%時得分由高到低依次是乳酸菌A50f7＞乳酸菌A50b9＞自然發酵。但是滋味評分中乳酸菌A50b9＞乳酸菌A50f7＞自然發酵，說明菌種不同發酵泡菜的品質也有所不同。而且當乳酸菌的接種量過大時，會對泡菜風味有一定程度的破壞。證明了人工接種適量乳酸菌發酵泡菜可以提高泡菜的品質和風味，有效的縮短泡菜的發酵周期。說明乳酸菌A50b9、A50f7具有做為泡菜發酵劑的潛能。

3 結論

本研究從貴州遵義市自制泡菜中分離得到143株乳酸菌，篩選得到11株產酸量較高的乳酸菌，產酸量均在1.89 g/L以上，經鑒定5株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），6株為副植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum），11株高產酸乳酸菌經過耐酸、耐膽鹽、抑菌和耐鹽性能的測定篩選得到兼有多種優良發酵性能的乳酸菌A50f7和A50b9并應用于泡菜。接種4%乳酸菌A50f7可以改善泡菜的品質和風味，發酵12 d就能達到所需pH值，縮短了泡菜的發酵周期，解決了工業生產中泡菜發酵周期長，生產效率低等問題，為乳酸菌泡菜發酵劑開發的菌種選育提供了依據。