特香型年份白酒揮發(fā)性成分氣相指紋圖譜實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的研究

楊 瑩，吳生文，林 培，徐柏田，熊秋萍

（四特酒有限責(zé)任公司，江西樟樹 331200）

年份酒作為一種高品質(zhì)產(chǎn)品的代表，在白酒行業(yè)內(nèi)已經(jīng)被推崇多年，具有較高年份的產(chǎn)品也被消費(fèi)者所追崇。近年來，由于缺乏規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)約束，沒有可以參照的年份酒產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，年份酒產(chǎn)品市場(chǎng)呈現(xiàn)較為混亂的現(xiàn)狀。只有制定出相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)管部門才能有法可依。然而這急需行業(yè)協(xié)會(huì)同白酒骨干企業(yè)一起，對(duì)年份酒進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化管理。指紋圖譜對(duì)樣品進(jìn)行定量分析是對(duì)復(fù)雜物系進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的一種重要方法，可以全面反映成分較復(fù)雜的樣品，更有效地體現(xiàn)產(chǎn)品的整體性[1-2]。指紋圖譜就像人的指紋一樣具有專一性和代表性，將處理后的實(shí)驗(yàn)樣品用光譜或者色譜的分析手段，得到能指示實(shí)驗(yàn)樣品唯一性的譜圖。迄今為止就有很多方法可以表征指紋圖譜，如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜（gas chromatography，GC）法、紅外光譜（infrared spectrometry，IR）法、核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）法等分析方法[3-4]。

氣相色譜法的分離原理是使混合樣品中各組分在兩相間進(jìn)行分配，其中一相為固定相，另一相則推動(dòng)混合物流過此固定相[5]，在同一推動(dòng)力作用下，不同的組分在固定相中的停留的時(shí)間不同，從而按照先后順序從色譜柱中流出[6-7]。氣相色譜法具有選擇性強(qiáng)、效能較高、靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用廣泛、操作簡(jiǎn)便，已成為一種極重要的現(xiàn)代分析工具[8-9]。氣相色譜在白酒分析中已得到了極其廣泛的應(yīng)用[10]。

目前，國(guó)內(nèi)大型白酒企業(yè)基本都已開始研究和應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)。例如：河北衡水老白干利用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用圖譜建立老白干酒風(fēng)味物質(zhì)指紋圖譜[11]；四川理工學(xué)院進(jìn)行濃香型白酒基酒指紋圖譜的模式識(shí)別研究[12]；司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所等研究GC-MS指紋圖譜并應(yīng)用在貴州茅臺(tái)酒的鑒別中[13]等。本實(shí)驗(yàn)建立特香型四特年份白酒的氣相色譜檢測(cè)方法，并對(duì)氣相指紋圖譜的實(shí)驗(yàn)方法學(xué)進(jìn)行考察，判斷檢測(cè)方法精密度、實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定性，并分析能否滿足氣相色譜指紋圖譜分析的技術(shù)要求，為后期制定特香型年份酒標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二十年成品白酒（45%vol）：四特酒有限責(zé)任公司；叔戊醇（純度≥99.6%）、乙酸正戊酯（純度≥99.4%）、乙醇（純度≥99.9%）、乙醛（純度≥99.8%）、甲酸乙酯（純度≥99.7%）、乙酸乙酯（純度100%）、乙縮醛（純度≥99.4%）、甲醇（純度≥99.4%）、異戊醛（純度≥98.2%）、仲丁醇（純度≥99.8%）、丁酸乙酯（純度≥99.8%）、正丙醇（純度≥99.8%）、異丁醇（純度≥99.8%）、戊酸乙酯（純度≥99.8%）、正丁醇（純度≥99.9%）、2-甲基-1-丁醇（純度≥99.6%）、異戊醇（純度≥99.8%）、己酸乙酯（純度≥99.8%）、正戊醇（純度≥99.8%）、醋嗡（純度≥99.3%）、庚酸乙酯（純度≥99.0%）、乳酸乙酯（純度≥99.8%）、正己醇（純度≥99.9%）、辛酸乙酯（純度≥99.6%）、糠醛（純度≥98.8%）、丙酸（純度≥99.8%）、2,3-丁二醇（左）（純度≥99.8%）、2,3-丁二醇（內(nèi)）（純度≥99.8%）、異丁酸（純度≥99.8%）、丁酸（純度≥99.7%）、異戊酸（純度≥99.0%）、戊酸（純度≥99.1%）、己酸（純度≥99.8%）、棕櫚酸乙酯（純度≥99.8%）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

8860型氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；DB-624UI毛細(xì)管色譜（30 m×0.53 mm×3.00 μm）：美國(guó)安捷倫科技有限公司；VORTEX-5KYLIN-BELL旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液制備

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[14]并略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱量2 mL乙酸正戊酯與2 mL叔戊醇的質(zhì)量，裝于100 mL的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容至刻度，配制2%（V/V）的內(nèi)標(biāo)溶液，并分別計(jì)算乙酸正戊酯與叔戊醇的含量，得出混合內(nèi)標(biāo)中叔戊醇含量為15.196 7 g/L，乙酸正戊酯含量為15.196 7 g/L。

1.3.2 白酒溶液制備

移液槍吸取1.3.1中配制的叔戊醇與乙酸正戊酯混合內(nèi)標(biāo)100 μL于100 mL白酒樣品中，漩渦振蕩混勻[15]。

1.3.3 氣相色譜條件

載氣（氮?dú)猓∟2））流速：1.5 mL/min；氫氣（H2）流速：30 mL/min；尾吹流速：40 mL/min；空氣流速：400 mL/min；檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器；氣化溫度：250 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

1.3.4 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)

取二十年四特酒樣品，按1.3.2方法制備白酒樣品溶液，按1.3.3的實(shí)驗(yàn)條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次。參照由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》[16]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)保留時(shí)間來標(biāo)定指紋峰。在四特酒二十年樣品的指紋圖譜中，內(nèi)標(biāo)叔戊醇用來標(biāo)定醇類物質(zhì)[17]，其相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)共有峰面積均設(shè)為1，以各共有醇類物質(zhì)指紋峰的保留時(shí)間、共有峰面積分別與叔戊醇保留時(shí)間、共有峰面積的比值作為各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積；內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯用來標(biāo)定除醇類以外的物質(zhì)[18]，相對(duì)保留時(shí)間為與相對(duì)共有峰面積設(shè)為1，以各共有指紋峰的保留時(shí)間、共有峰面積分別與乙酸正戊酯保留時(shí)間、共有峰面積的比值作為各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

（2）重現(xiàn)性試驗(yàn)

取叔戊醇與乙酸正戊酯試劑按1.3.1方法制備5份內(nèi)標(biāo)，按1.3.3實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間與峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值，判斷內(nèi)標(biāo)溶液配制方法的重現(xiàn)性。分別取同一個(gè)二十年四特酒酒樣5次，分別按照1.3.2方法配制酒樣溶液，按1.3.3實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定，并對(duì)共有峰相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一個(gè)二十年四特酒酒樣，按1.3.2方法制備酒樣溶液，按1.3.3實(shí)驗(yàn)條件下分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h下進(jìn)樣，實(shí)驗(yàn)間隔期將白酒樣品用封口膜封口，并放置于冰箱內(nèi)保存，對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 二十年特香白酒揮發(fā)性成分分析氣相色譜圖

取四特酒二十年酒樣按1.3.2方法制備酒樣，根據(jù)前期摸索實(shí)驗(yàn)條件：載氣（氮?dú)猓┝魉贋?.5 mL/min；分流比30∶1；程序升溫：初始溫度40 ℃，保留4 min，以3 ℃/min的速率升溫到80 ℃，保留3 min，第二階段以8 ℃/min的速率升溫到200 ℃，保留8 min，運(yùn)行40 min的氣相色譜圖見圖1。

圖1 特香型年份酒中揮發(fā)性成分的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of volatile components in Te-flavor aged Baijiu

由圖1可以看出，主要色譜峰在0～40 min之間比較均勻分布、色譜峰的峰型較好、混合物中各組分能分離。說明在此條件下，分離效果較佳，預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的檢測(cè)條件適合用于研究?jī)x器精密度、方法重現(xiàn)性以及樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)。

2.2 精密度試驗(yàn)

內(nèi)標(biāo)叔戊醇用來標(biāo)定醇類物質(zhì)，內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯用來標(biāo)定除醇類以外的物質(zhì)，以各共有指紋峰的保留時(shí)間與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間的比值作為各峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見表1。以各共有峰面積與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為各峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2。

表1 以相對(duì)保留時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)的方法精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of method precision tests using relative retention time as evaluation index

表2 以相對(duì)峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)的方法精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of method precision tests using relative peak area as evaluation index

續(xù)表

由表1、表2可以看出，在方法精密度試驗(yàn)中，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜0.03%，相對(duì)峰面積RSD均＜3.0%。結(jié)果表明，該方法的精密度較好。

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取叔戊醇與乙酸正戊酯試劑按1.3.1方法制備5份內(nèi)標(biāo)，并按1.3.3實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定內(nèi)標(biāo)叔戊醇、乙酸正戊酯保留時(shí)間分別為11.142 min、17.803 min，其RSD均為0.01%；峰面積平均值分別為24.071、21.718，其RSD分別為1.21%、2.41%，表明內(nèi)標(biāo)溶液配制方法的重現(xiàn)性良好。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行樣品方法重現(xiàn)性試驗(yàn)，結(jié)果分別見表3、表4。

表3 以相對(duì)保留時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)的方法重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of method reproducibility tests using relative retention time as evaluation index

續(xù)表

表4 以相對(duì)峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)的方法重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of method reproducibility tests using relative peak area as evaluation index

續(xù)表

由表3、表4可知，氣相圖譜中的醇、醛、酸、酯類峰相對(duì)保留時(shí)間均＜0.03%，相對(duì)峰面積RSD均＜3.0%。結(jié)果表明，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確重現(xiàn)性較好[19-20]。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)樣品間隔進(jìn)樣，分析樣品的穩(wěn)定性，樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果分別見表5、表6。

表5 以相對(duì)保留時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)的樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of sample stability tests using relative retention time as evaluation index

表6 以相對(duì)峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)的樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results sample stability tests using relative peak area as evaluation index

由表5、表6可以看出，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜0.03%，相對(duì)峰面積RSD均＜3.0%。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性良好，檢測(cè)結(jié)果在24 h內(nèi)較穩(wěn)定[21-22]。

3 結(jié)論

以氮?dú)猓∟2）為載氣，流速為1.5 mL/min；分流比30∶1；程序升溫：初始溫度40 ℃，保留4 min，以3 ℃/min的速率升溫到80 ℃，保留3 min，第二階段以8 ℃/min的速率升溫到200 ℃，保留8 min的參數(shù)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分離效果較佳，預(yù)試驗(yàn)建立的氣相特香型年份白酒指紋圖譜的方法與條件可行。在上述實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了考察，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD，判斷方法的可行性。其精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜0.03%，相對(duì)峰面積RSD均＜3.0%。結(jié)果表明，氣相色譜檢測(cè)精密度、重現(xiàn)性良好、穩(wěn)定可行，能夠滿足特香型四特年份酒指紋圖譜的技術(shù)要求。