超高效液相色譜-電化學(xué)檢測法測定不同產(chǎn)地鹽膚木中的酚類化合物

張 萍 胡克特 陳榮祥 顧 丁

（遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000）

鹽膚木（Rhus chinensis）又稱五倍子樹，是我國重要的經(jīng)濟(jì)型樹種，兼具藥用、觀賞、工業(yè)、日用等價值，也可用于環(huán)境修復(fù)，對多種重金屬尤其是鎘(Cd)具有較強(qiáng)的吸附性能[1-2]。鹽膚木葉片被癭綿蚜科（Pemphigidae）蚜蟲（Pemphigidae aphids）轉(zhuǎn)寄主寄生后而形成的蟲癭稱為五倍子，含有大量的單寧，是重要的資源昆蟲產(chǎn)物之一，有染色、解毒、消炎、抗菌的功效[3-4]。鹽膚木根部較為發(fā)達(dá)，常用于治療胃腸道疾病和泌尿系統(tǒng)疾病，具有抗病毒、抗菌、止瀉、抗氧化、抗膽固醇等作用，具有潛在的預(yù)防和減輕酒精性脂肪肝的價值[5-6]。因此，鹽膚木是很多中成藥的組成部分[7-8]。我國的鹽膚木主要分布在貴州、陜西、四川、湖北等省份，因生長環(huán)境的不同，鹽膚木根和五倍子的質(zhì)量也存在了一定的差異，并且多個研究表明不同地理因素可造成植物中成分含量的差異[9-10]。鹽膚木根與五倍子同為鹽膚木所產(chǎn)的中藥材產(chǎn)品，含有大量單寧及其衍生物，在目前的研究中關(guān)于五倍子的成分分析與藥理活性研究較多，而鹽膚木根卻少有人研究，且在藥用方面五倍子多用于中藥方劑與制劑，而鹽膚木根除作為中藥材入藥以外，還常被添加進(jìn)藥膳食用，并且二者的化學(xué)成分以及生理活性差異較大[5]。

植物的化學(xué)成分及其活性研究對于其資源開發(fā)和保護(hù)具有重要意義[11-12]，鹽膚木根以及制劑中的化學(xué)成份有一定的研究，但多以沒食子酸含量為指標(biāo)，采用高效液相色譜（HPLC）對鹽膚木的復(fù)方及單味藥制劑進(jìn)行含量測定研究[8]。然而，鹽膚木中具有生理活性的成分種類繁多，如酚酸、黃酮、三萜酸、多糖等[13-15]。其中酚類化合物的含量與種類尤其豐富，主要包括沒食子酸、苔黑酚及其衍生物如五沒食子酰葡萄糖、苔黑酚葡萄糖苷等[16]。因此，單獨(dú)以沒食子酸作為評價其質(zhì)量的指標(biāo)，不足以令人信服。也有文獻(xiàn)采用分光光度對總酚酸的含量進(jìn)行測定，但是該方法無法對單個化合物進(jìn)行定量，也無法詳細(xì)評價地區(qū)間樣品的差異[17-19]。因此，以色譜法對鹽膚木中的主要化學(xué)成分進(jìn)行分離和檢測是評估其質(zhì)量的有效手段，然而鹽膚木中酚類化合物化學(xué)性質(zhì)接近，采用常規(guī)的液相色譜進(jìn)行分離耗時較長，時間和經(jīng)濟(jì)成本均較高，所檢測指標(biāo)一般較少[20]，而超高效液相色譜（UPLC）較HPLC具有更高的分離度和靈敏度，通常采用亞2 μm填料色譜柱，可以縮短分析時間，提高分離效率，所以目前越來越廣泛用于天然產(chǎn)物成份分離[21]。例如李鷙等[22]采用超高效液相色譜對鹽膚木中的8種成分進(jìn)行了分離，并對福建、廣東和安徽等省份的鹽膚木進(jìn)行了測定。相對于光學(xué)檢測器，電化學(xué)檢測器（ECD）靈敏度極高，同時具有良好的選擇性，在藥品和食品質(zhì)量控制方面發(fā)揮重要的作用，尤其適合檢測酚類[23]、硫醇和雜環(huán)類化合物[24]。由于其僅對具有電化學(xué)活性的化合物有響應(yīng)，因此形成的色譜圖干擾較少，基線平穩(wěn)。酚類化合物具有較強(qiáng)的還原性，直流模式下較低的檢測電壓即可進(jìn)行檢測，并且該條件下，糖類、有機(jī)酸、生物堿類均不干擾檢測[9]。因此，本研究以酚類化合物作為檢測指標(biāo)，聯(lián)合UPLC與ECD用于鹽膚木根的成分分析，建立同時測定鹽膚木根中9種酚類化合物含量的方法，并對11批鹽膚木樣品進(jìn)行聚類分析與主成分分析，為各地鹽膚木根的品質(zhì)評估提供參考依據(jù)，為該藥材指標(biāo)性成分的選擇、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和全面質(zhì)量控制提供參考，促進(jìn)全國鹽膚木產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鹽膚木根樣品采集自浙江、廣東、福建、貴州、廣西等11個地區(qū)，用自來水清洗干凈，置于干燥箱50 ℃烘干，粉碎后過60目篩備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的制備

取處理好的樣品粉末，用電子天平（精確至0.1 mg）精確稱取0.1 g，加80%甲醇5 mL，超聲50 min，得到的萃取液取2 mL離心，上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)樣分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的制備

沒食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、表沒食子兒茶素、沒食子酸甲酯、苔黑酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸乙酯、表兒茶素沒食子酸酯、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖9種酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量，用甲醇溶解、定容，配制成1 mg/mL儲備液于-20 ℃儲存?zhèn)溆?，使用前將?biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成所需濃度，標(biāo)準(zhǔn)品均購自阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2.3 UPLC測定鹽膚木根中酚類化合物的含量

采用UltiMate 3000 Bio-RS型超高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司，美國）進(jìn)行色譜分離。色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相條件為50 mmol/L檸檬酸鹽溶液（pH 2.9）與甲醇，按以下梯度程序洗脫：0～14 min，10%～35% 甲醇；之后采用40% 甲醇沖洗2 min后回到初始梯度并平衡4 min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積1 μL。3000 RS 電化學(xué)檢測器（賽默飛世爾科技有限公司，美國）檢測電壓為600 mV，3400 RS 二極管陣列檢測器（賽默飛世爾科技有限公司，美國）檢測波長275 nm。

1.2.4 測定方法驗(yàn)證

準(zhǔn)確移取不同體積的鹽膚木標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（1 000 mg/L），加甲醇稀釋，分別配制濃度為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，按照優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行檢測，以峰面積作為縱坐標(biāo)，樣品濃度作為橫坐標(biāo)，計算線性方程以及相關(guān)系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行聚類分析、主成分分析和因子分析，將數(shù)據(jù)進(jìn)行分類、降維得出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇及優(yōu)化

2.1.1 流動相條件的優(yōu)化

因電化學(xué)檢測器必須在一定的緩沖鹽中運(yùn)行檢測，而酸性環(huán)境有利于酚類化合物的分離。因此，以50 mmol/L檸檬酸鹽為緩沖溶液，由pH 7開始逐步降低其pH，當(dāng)pH下降到3以下時，9種酚類化合物峰形良好，最終確定以50 mmol/L檸檬酸鹽（pH 2.9）-甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的流動相檢測條件，進(jìn)行梯度洗脫。

2.1.2 檢測電壓的選擇

本實(shí)驗(yàn)前期將流動相條件進(jìn)行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上將檢測池的電壓由低到高以50 mV為間距，從0 mV升高至700 mV。將同一份樣品重復(fù)進(jìn)樣，考察由檢測電壓的變化引起的9種酚類化合物的響應(yīng)值的變化，以確定最佳的電壓檢測條件。由圖1可知，當(dāng)電壓低于600 mV時，各成分的峰響應(yīng)值隨電壓增大而增大，600～650 mV趨于平緩且大部分酚類化合物在600 mV時響應(yīng)值最高，至650 mV以后，峰面積有下降趨勢，而噪音快速增加。故選擇600 mV作為鹽膚木中各成份的檢測電壓。

圖1 不同檢測電壓下酚類化合物的響應(yīng)變化趨勢Fig.1 Trend of peak area of phenolic compounds under different potentional

2.2 方法驗(yàn)證與樣品含量檢測

2.2.1 方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

9種酚類化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999 0。以3倍信噪比計算檢測限，不同化合物的檢測限在1.8～16.9 μg/L之間，見表1。

表1 鹽膚木中9種酚類化合物線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Linear relationship of 9 phenolic compounds in R.chinensis

按優(yōu)化后的色譜條件對9種酚類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明9種酚類化合物的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.53%～0.84%，精密度良好。按試驗(yàn)方法對同一份樣品進(jìn)行分析，平行測定6次，峰面積的RSD為0.72%～3.07%，重復(fù)性良好。按試驗(yàn)方法對鹽膚木樣品進(jìn)行處理，4 ℃存儲，分別于0、2、4、8、10、12 h進(jìn)行測定。結(jié)果表明峰面積的RSD為1.03～2.16%，說明樣品在4 ℃存儲具有較好的穩(wěn)定性。按試驗(yàn)方法對已知濃度樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)水平1∶1，重復(fù)5次，計算得出的9種酚類化合物的回收率為95.3%～102.1%，RSD小于5%，說明本方法準(zhǔn)確可靠。

2.2.2 樣品含量檢測

將11個地區(qū)的鹽膚木樣品產(chǎn)地信息進(jìn)行記錄，如表2，采用優(yōu)化的提取條件和色譜條件對鹽膚木樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品的色譜圖見圖2。

表2 11個樣品產(chǎn)地地理信息匯總Table 2 Geographic information summary of 11 samples

表3 11批鹽膚木樣品中酚類化合物含量測定結(jié)果Table 3 Determination of phenolic compounds in the samples of R.chinensis from 11 regions mg/g

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard solution and sample

2.3 聚類及主成分分析

為了將11批鹽膚木樣品進(jìn)行歸類分析，使用軟件SPSS 24.0，采用系統(tǒng)聚類法，以組間聯(lián)接法為聚類方法，以平均歐式距離為聚類距離對11批省份的鹽膚木樣品進(jìn)行聚類分析（如圖3）。聚類 結(jié) 果 主 要 分 成3類：S2、S4、S10、S11為 第1類；S1、S5、S6、S7、S8、S9為第2類，S3為單獨(dú)一類。

將樣本聚類整理分析后，繼續(xù)使用SPSS 24.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件、以9種酚類化合物以及對應(yīng)的矩陣進(jìn)行主成分分析和因子分析。數(shù)據(jù)經(jīng)KMO（0.687）與巴特利特球型度檢驗(yàn)后確定適合進(jìn)行主成分分析，因此取特征值＞1且統(tǒng)計顯著水平的數(shù)據(jù)作為主要成分，可將鹽膚木樣品的9種酚類化合物分為3個主要成分，如表4。利用得到的數(shù)據(jù)繪制散點(diǎn)圖，發(fā)現(xiàn)大部分樣本與主成分1較為靠近，見表5、圖4。

圖3 11批鹽膚木樣品中酚類化合物含量的聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis tree diagram of the samples of R.chinensis from 11 regions

表4 3個主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalues and variance contribution rates of 3 principal components

表5 初始因子載荷矩陣Table 5 Loading factor of principal components

圖4 11批鹽膚木樣品中酚類化合物含量的PCA分析Fig.4 Principal component analysis of phenolic compounds in the samples of R.chinensis from 11 regions

2.4 UPLC-ECD與其他方法的比較

鹽膚木中含有大量酚類化合物，多采用紫外檢測器在波長275 nm附近檢測[22]。將同一樣品在相同色譜條件下，將電化學(xué)檢測器和紫外線檢測器形成的的色譜圖進(jìn)行對比，圖5為樣品采用DAD檢測的色譜圖，樣品與圖2b為同一樣品，二者的色譜條件除檢測器外完全一致，可見電化學(xué)檢測的出峰效率和峰型狀態(tài)都比DAD檢測器好。電化學(xué)檢測器靈敏度高，快速準(zhǔn)確，更有利于鹽膚木各成份的分離檢測。

圖5 UPLC-DAD色譜圖Fig.5 Chromatogram of UPLC-DAD

3 結(jié)論與討論

鹽膚木生長在在全年平均氣溫8～20 ℃，年降水量600 mm以上，質(zhì)地為沙壤、中壤，土壤pH值為微酸、微堿性的環(huán)境條件中。不同產(chǎn)地的鹽膚木因?yàn)榈乩憝h(huán)境的不同，酚類化合物的含量也有了差異。我們以酚類化合物作為指標(biāo)，對11個地區(qū)的鹽膚木樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S3、S10、S11樣本含量較高，分別含有18.944、11.362、10.178 mg/g。9種酚類化合物在11批鹽膚木樣本中的均值以沒食子酸最高，含有2.656 mg/g。主成分分析將樣品分成3個主要成分，主成分1的信息主要來自沒食子酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖，主成分2的信息主要來自苔黑酚葡萄糖苷、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯，主成分3的信息主要來自表沒食子兒茶素、苔黑酚，說明樣品間的生長習(xí)性和品質(zhì)有一定的相似性，這一結(jié)果對于鹽膚木根質(zhì)量的地區(qū)選擇與歸類有一定的參考依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了UPLC-ECD同時測定沒食子酸、苔黑酚葡萄糖苷、表沒食子兒茶素、沒食子酸甲酯、苔黑酚、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸乙酯、表兒茶素沒食子酸酯、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖等9種酚類化合物含量的方法，并比較了11個地區(qū)鹽膚木樣品中9種酚類化合物的含量。該方法快速簡便準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，可為鹽膚木藥材藥理質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。