響應曲面法優化蒺藜中黃酮和皂苷的提取工藝*

張 劍，譚健聰，楊鈺蓉，張 博，韓 祿，劉春葉

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

蒺藜為蒺藜科植物蒺藜的干燥成熟果實，在中國有著悠久的用藥歷史，歷代醫學家對其多有論述和應用，目前為臨床常用藥，并被收載入中國藥典。現代研究表明，蒺藜在心腦血管、抗氧化、抗衰老、改善性功能、治療皮膚病等方面具有重要作用[1-2]。蒺藜水溶性成分主要是黃酮、皂苷類，黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、清除自由基等多種生物活性[3-5]，蒺藜皂苷可以減少自由基的生成，促進自由基的清除，減輕脂質過氧化反應[6-7]。蒺藜提取物可通過干擾花生四烯酸代謝調節血小板黏附、抗血小板凝集和抗氧化功能，對心血管疾病具有預防作用[8]。李明娟等[9]和Sharawy等[10]研究認為，蒺藜提取物能夠顯著抑制動物的糖異生作用，同時顯著降低血清甘油三酯含量。因此，從蒺藜中高效、經濟地提取黃酮和皂苷類成分，使蒺藜更廣泛地得到應用顯得尤為重要。

現有的報道大多以蒺藜果為研究對象[11-13]，并且是以蒺藜中單一組分的提取作為研究目標[14-17]，將黃酮和皂苷同時提取并比較蒺藜果和葉中含量的研究并不多見[5]。作者采用綜合評價較高的微波輔助法[11]對蒺藜中黃酮和皂苷同時提取，對比了蒺藜葉和果實中總黃酮和總皂苷的含量，通過響應曲面法對提取工藝條件進行優化，以期得到蒺藜中總黃酮和皂苷的最佳提取條件，為蒺藜的開發利用奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

蒺藜果實和葉：產自陜北，經西安醫學院生藥教研室張寒副教授鑒定為蒺藜科植物蒺藜的果實和葉。

薯蕷皂苷：B21176-20mg，蘆丁：B20771-20mg，上海源葉生物科技有限公司；水為超純水；其余試劑均為分析純，市售。

電熱恒溫水浴鍋：HH-2，北京科偉永興儀器有限公司；電腦微波超聲波組合萃取儀：XH-300A，北京祥鵠科技發展有限公司；紫外分光光度計：UV762，上海佑科儀器儀表有限公司；循環水真空泵：SHZ-DⅢ，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的制作

(1)黃酮標準曲線的制作[18]。精密稱取蘆丁標準品14.7 mg，加適量甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中，得蘆丁標準品儲備液，用移液管精密吸取該溶液0、1、2、3、4、5和6 mL分別置于25 mL容量瓶中，加0.04 g/mL NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min后加入0.1 g/mL Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置6 min后加入0.1 g/mL NaOH溶液10 mL，最后用水稀釋至刻度，搖勻放置15 min。在200～600 nm掃描標準品最大吸收波長，在最大吸收波長處測量吸光度。以吸光度為縱坐標，蘆丁質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為y=17.75x+0.005 5，R2=0.998 6。

(2)皂苷標準曲線的制作[18]。精密稱取薯蕷皂苷9.1 mg，加甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中，得薯蕷皂苷標準品溶液。精密吸取該溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00和1.20 mL于7支具塞試管中，水浴加熱揮去溶劑。在每支試管中精密加入高氯酸5 mL，密塞，于25 ℃水浴30 min。取出后立即放入冰水中冷卻，在300～500 nm掃描標準品最大吸收波長，在最大吸收波長處測量其吸光度。以吸光度為縱坐標，薯蕷皂苷質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為y=29.867x+0.038 1，R2=0.999 6。

1.2.2 蒺藜中總黃酮與總皂苷成分的提取方法及提取率比較

分別取蒺藜葉和果實飲片，粉碎，過孔徑380 μm篩[14]，分別用石油醚回流3 h脫脂，陰干，得供試品粉末，于密封袋中保存備用。精密稱取供試品粉末1.00 g，加入乙醇靜置20 min后進行微波提取，減壓過濾提取液，取濾液減壓蒸餾至干，使用甲醇超聲溶解并定容至50 mL容量瓶中，作待測液供黃酮和皂苷提取率測定，比較蒺藜葉和果實的提取率。

1.2.3 單因素實驗

以黃酮和皂苷提取率為考察指標，在微波功率為300 W的條件下分別考察提取時間、提取溫度、m(提取液)∶m(原料)(以下簡稱液料比)、φ(乙醇)4個因素對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響。

1.2.4 響應曲面法優化提取工藝

在單因素實驗基礎上，確定自變量，分別以黃酮提取率和皂苷提取率為響應值，采用Box-Behnken實驗方法對實驗的提取溫度、提取時間、液料比和φ(乙醇)進行四因素三水平實驗設計。數據處理采用Design Expert.V 8.0.6.1軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 蒺藜葉和果實活性成分提取率比較結果

蒺藜葉和果實活性成分提取率見表1。

表1 葉和果實提取率比較結果

由表1可知，蒺藜葉中活性成分提取率顯著高于果實活性成分提取率，故選擇蒺藜葉作為蒺藜活性成分提取工藝優化的原料，擴大中藥來源，可為藥材的選擇提供借鑒和參考。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 提取時間對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g，固定提取溫度為30 ℃，功率為300 W，液料比為30，φ(乙醇)=70%，靜置20 min后提取，設定提取時間分別為5、10、15、20、25、30和35 min，考察提取時間對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響，結果見圖1。

t/min圖1 微波時間對黃酮及皂苷提取率的影響

由圖1可知，在提取過程中，隨著時間的增加，黃酮和皂苷提取率逐漸增加，這是因為溶劑隨時間增長逐漸滲透到細胞內部，直至皂苷和黃酮達到溶解平衡。在提取時間為25 min黃酮和皂苷的提取率達到最大值。時間繼續延長，提取率有所下降，這可能是由于時間過長導致過多雜質也隨之析出，且目標產物也容易分解，從而影響黃酮和皂苷的收率[18]。

2.2.2 提取溫度對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g，固定提取時間為25 min，功率為300 W，液料比為30，φ(乙醇)=70%，靜置20 min后提取，設定提取溫度分別為30、40，50、60和70 ℃，考察提取溫度對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響，結果見圖2。

t/℃圖2 溫度對黃酮和皂苷提取率的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，黃酮提取率逐漸升高，在60 ℃時提取率趨于穩定；皂苷提取率先上升，60 ℃后有下降的趨勢。由此說明，提取溫度也不是越高越好，因為提取溫度過高可能導致目標產物的分解，提取率反而下降[19]。

2.2.3 液料比對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g，固定提取時間為25 min，提取溫度為60 ℃，功率為300 W，φ(乙醇)=70%，設定液料比10～70，靜置20 min后提取，考察液料比對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響，結果見圖3。

液料比圖3 液料比對黃酮和皂苷提取率的影響

由圖3可知，液料比對黃酮和皂苷提取率影響較大，隨著液料比逐漸增大，黃酮和皂苷提取率有較大的提升，在液料比為50時趨于穩定，若進一步擴大液料比不僅對黃酮和皂苷提取率貢獻意義不大，反而增加了提取成本。

2.2.4φ(乙醇)對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響

精密稱取蒺藜葉供試品粉末1.00 g，固定提取時間為25 min，功率為300 W，液料比為50，提取溫度為60 ℃，靜置20 min后提取，設定φ(乙醇)=10%、30%、50%、70%和90%，考察φ(乙醇)對蒺藜黃酮和皂苷提取率的影響，結果見圖4。

φ(乙醇)/%圖4 φ(乙醇)對黃酮和皂苷提取率的影響

由圖4可知，隨著φ(乙醇)的升高，黃酮和皂苷提取率變化顯著，呈先升后降的趨勢，當φ(乙醇)=70%，黃酮和皂苷提取率同時達到最大值。

2.3 響應面實驗結果與分析

根據蒺藜黃酮和皂苷單因素提取結果，得蒺藜黃酮和皂苷提取率(Y1和Y2)為評價指標，對微波提取時間(A)、微波提取溫度(B)、液料比(C)、φ(乙醇)(D)為主要影響因素，每個因素3個水平，Box-Behnken實驗設計的因素水平表見表2，響應面實驗設計及結果見表3。

表2 蒺藜黃酮和皂苷提取實驗因素水平及編碼

表3 響應面實驗設計及結果

續表

2.3.1 方差分析

分別對以黃酮和皂苷提取率為響應值建立的回歸模型進行方差分析，考察回歸模型的顯著性、重現性、擬合程度以及各因素對響應值的影響情況。

(1)以黃酮提取率為響應值的回歸模型方差分析結果見表4。

表4 以黃酮提取率為響應值的回歸模型方差分析1)

由表4可知，該模型P<0.000 1，表明模型達到高度顯著水平。失擬項P=0.067 3>0.05，表現為不顯著；校正確定系數R2=0.902 0，說明該模型能解釋90.20%的響應值變化，擬合程度良好，能夠較好地反映微波提取時間，微波提取溫度，液料比和φ(乙醇)與蒺藜黃酮提取率的關系；模型響應值的變異系數CV=5.90%，表明實驗操作重復性好(<10%)。因此可以用此模型對蒺藜黃酮提取進行分析和預測，各因素對蒺藜黃酮提取率影響的大小順序為溫度>液料比>時間>φ(乙醇)。各因素對蒺藜黃酮提取率的交互影響不顯著。

(2)以皂苷提取率為響應值的回歸模型方差分析見表5。

表5 以皂苷提取率為響應值的回歸模型方差分析1)

由表5可見，該模型P=0.002 1，達到極顯著水平；失擬項P=0.004，表現為極顯著，說明實驗中存在誤差較大的失擬因素；校正確定系數R2=0.837 4，說明該模型能解釋83.74%的響應值變化；變異系數CV=2.66%，說明該實驗重復性良好(<10%)；4個因素中，溫度、φ(乙醇)對響應值影響極顯著，按影響大小排序為溫度>φ(乙醇)>液料比>時間；X1X2、X2X3、X3X4、X1X3、X1X4、X2X4的P值均大于0.1，說明各因素對響應值的交互影響不顯著。

2.3.2 各因素交互作用分析

(1)以黃酮提取率為響應值的響應曲面分析。根據響應面軟件可以得到各因素間對蒺藜中黃酮提取率的交互影響3D響應面圖，見圖5～圖8。

圖5 溫度和時間交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應面圖

圖6 時間和液料比交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應面圖

圖7 φ(乙醇)和液料比交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應面圖

圖8 溫度和φ(乙醇)交互作用對蒺藜總黃酮提取率影響的3D響應面圖

響應面圖中越陡峭的一方，其對提取的影響越大。由圖5可知，溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響大于提取時間的影響；由圖6可知，液料比的影響略大于提取時間的影響；由圖7可知，φ(乙醇)對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于液料比的影響；由圖8可知，溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于φ(乙醇)的影響。由此可得，溫度對蒺藜中黃酮的提取率影響最大，其次是φ(乙醇)、液料比和提取時間，與方差分析得出的結論一致。

(2)以皂苷提取率為響應值的響應曲面分析。根據響應面軟件可以得到各因素間對蒺藜中皂苷提取率的交互影響3D響應面圖見圖9～圖12。

圖9 溫度和時間交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的3D響應面圖

圖10 時間和液料比交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的3D響應面圖

圖11 φ(乙醇)和液料比交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的3D響應面圖

圖12 溫度和φ(乙醇)交互作用對蒺藜總皂苷提取率影響的等高線圖和3D響應面圖

響應面圖中越陡峭的一方，其對提取的影響越大。由圖9可知，溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響大于提取時間的影響；由圖10可知，液料比的影響略大于提取時間的影響；由圖11可知，φ(乙醇)對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于液料比的影響；由圖12可知，溫度對蒺藜中黃酮提取率的影響要明顯大于φ(乙醇)的影響。由此可得，溫度對蒺藜中皂苷的提取率影響最大，其次是φ(乙醇)、液料比和提取時間，與方差分析得出的結論一致。

2.3.3 最佳條件預測與驗證

通過Design Expert軟件進行數據擬合分析，得到最佳提取工藝為時間20.32 min，溫度70 ℃，液料比70，φ(乙醇)=69.88%。在此條件下，黃酮和皂苷提取率分別為0.71%、2.02%。平行進行3組實驗對最佳工藝進行驗證，為了便于操作，選取提取時間為20 min，φ(乙醇)=70%，溫度為70 ℃，液料比為70。結果表明，總黃酮的提取率分別為0.69%、0.71%、0.68%，平均值為0.69%；總皂苷提取率分別為1.99%、2.11%、1.98%，平均值為2.03%，與預測值基本吻合，說明預測模型可靠。

3 結 論

蒺藜葉中活性成分提取率顯著高于果實活性成分提取率；響應曲面法不但可以對微波輔助提取蒺藜中黃酮和皂苷工藝條件進行優化，還可以對最佳提取條件下的提取率進行預測，預測值與實際測量值吻合度較高。研究的最佳提取產率高于相關文獻報道[14,18]，由此表明，該方法能兼顧2種活性成分提取率的最大化，避免生產中的資源浪費，對資源的合理開發利用具有一定的指導意義，也可為相關研究和工業化生產工藝條件的優化提供借鑒和參考。