黃連-吳茱萸不同比例配伍水提物對線蟲的毒性效應評價

路穎慧 康念欣 袁炎炎 李晴霞 譚鵬

摘要 目的：評價不同比例黃連-吳茱萸配伍提取物對秀麗隱桿線蟲的毒性效應。方法：以秀麗隱桿線蟲為模式生物，制備不同比例黃連-吳茱萸配伍水提物，測定各水提物對秀麗隱桿線蟲壽命、體長及運動行為的影響。每組30條線蟲觀察存活率，每天在相同時間觀察線蟲數量，以最后一條線蟲死亡時間作為最長壽命;每組40條線蟲觀察體長，用Image J軟件測量死亡線蟲虛擬體長;每組30條線蟲觀察頭尾擺動和身體彎曲頻率，測定1 min內線蟲頭部擺動的次數（從一側擺向另一側再擺回來）和20 s內身體彎曲的次數（認為線蟲相對于身體的長軸移動一個正弦周期的波長為1次身體彎曲）。結果：與黃連組比較，隨吳茱萸相對比例增加，秀麗隱桿線蟲的死亡率顯著降低（P<0.01）;體長顯著減少（P<0.01）;對秀麗隱桿線蟲的運動行為沒有明顯的抑制作用。結論：吳茱萸在一定程度上能夠降低黃連對秀麗隱桿線蟲的毒性，延長其壽命;在生長發育和神經方面影響較小，本研究為黃連和吳茱萸的配伍與炮制減毒研究提供了新的方法。

關鍵詞 黃連;吳茱萸;秀麗隱桿線蟲;壽命;體長;運動行為;毒性;炮制減毒

Abstract Objective：To evaluate the toxic effects of different proportions of Coptidis Rhizoma and Tetradium ruticarpum extracts on Caenorhabditis elegans.Methods：Coptidis Rhizoma was used as model organism and preparing water extracts of Coptidis Rhizoma and Tetradium ruticarpum in different proportions。Assessing the effects of various water extracts on the survival rate，body length，head and tail swinging frequency and body bending frequency of C.elegans.The number of 30 C.elegans were observed and counted at the same time every day，and the death time of the last C.elegan was taken as the maximum life span.The body length of 40 C.elegans was measured by Image J software after C.elegans were killed in the oven and photographed.Counting the number of head and tail swinging frequency of 30 C.elegans in 1min（from one side to the other and back again） and the number of body bending frequency of 30 C.elegans in 20s（the movement of nematodes relative to one wavelength along the long axis of the nematode was taken as one body bending） to evaluate the effects on motor behavior of C.elegans.Results：Compared with the group of Coptidis Rhizoma，as the relative proportion of Tetradium ruticarpum increasing，the mortality rate of C elegans was significantly decreased（P<0.01）.The body length was significantly reduced（P<0.01）.In the aspect of locomotion behavior，the addition of Tetradium ruticarpum can′t significantly reduces the frequency of head swing and body flexion of C.elegans.Conclusion：To a certain degree Tetradium ruticarpum can reduce the toxicity of Coptidis Rhizoma to C elegans，extending its life.In terms of growth and nerves，it has less affection.And the research provided a new method for the study of Coptidis Rhizoma and Tetradium ruticarpum in pairing and concoction.

Keywords Coptidis Rhizoma; Tetradium ruticarpum; Caenorhabditis elegans; Lifespan; Body length; Sports behavior; Toxicity; Concoct attenuation

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.002

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖。苦，寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經。具有清熱燥濕，瀉火解毒的作用，用于濕熱痞滿，嘔吐吞酸，瀉痢等癥[1]。黃連中所含化學成分主要有生物堿類，以小檗堿含量最高，還有巴馬汀、表小檗堿、四氫小檗堿等。除此之外，還含有木脂素類、黃酮類、鞣質、酸性成分、多糖等多種成分。在降糖、抗菌、抗炎、抗氧化等方面有顯著的藥理作用[2]。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實。辛、苦，熱，有小毒，歸肝、脾、胃、腎經[1]。具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉的功效[3]，用于厥陰頭痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣等癥。吳茱萸中所含化學成分主要有生物堿類，以吳茱萸堿和吳茱萸次堿為主，還有揮發油、檸檬苦素類和黃酮類化合物等多種成分[4-5]。在抗腫瘤、抗炎鎮痛、抑菌、降血脂等方面有顯著的藥理作用。

黃連和吳茱萸常配伍或炮制后使用。萸黃連，即以吳茱萸煎液與凈黃連拌勻，待液吸盡，炒干，具有疏肝和胃止嘔的作用，用于肝胃不和，嘔吐吞酸[1]。二者配伍使用的歷史非常悠久，首載于北宋的《太平圣惠方》，黃連-吳茱萸1∶1配伍組成茱萸丸，用于下痢水瀉[6]。最著名的是朱震亨的《丹溪心法·火六》中記載的左金丸，由黃連-吳茱萸6∶1配伍而成。此外，歷代還有許多黃連-吳茱萸配伍的方劑。見表1。

黃連、吳茱萸一苦一辛、一寒一熱、一陰一陽，二藥配伍體現了“辛開苦降”“反佐”的思想，是中醫治療八法中“和”法的代表，極具中醫特色[7-8]。因此，黃連-吳茱萸配伍的藥理作用一直是研究的熱點。有研究發現，黃連水提物可對小鼠造成急性毒性作用，其毒性與乙酰膽堿酯酶抑制、腸道P-糖蛋白功能受損、腸黏膜Ⅰ相及Ⅱ相代謝能力降低等因素有關[9]。有文獻報道黃連經口急性毒性LD50為18.82 g/kg。有研究者以0.5 mg/mL劑量以0.2 mL/10 g灌胃小鼠，造成肝損傷，其病理變化隨著劑量的增加而加重[10]。而在黃連之前給予吳茱萸，其毒性明顯降低。

評價中藥的毒性，主要采用動物實驗，以嚙齒類動物如大鼠、小鼠、豚鼠等為主，也有應用犬或猴為實驗對象的[11]。這些實驗動物價格高昂、飼養困難、試驗周期長，而且傳統化學藥物的毒理學評估方式不能解釋清楚成分復雜的中藥的毒性機制。所以，評價中藥的毒性需要一種迅速、簡便、可靠的方法。作為一種結構簡單、生命周期短，與人類基因保守性較高的模式動物[12]，秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis Elegans，簡稱“線蟲”）因此被廣泛用于生命科學領域。李煜等[13]以秀麗隱桿線蟲的發育、運動、消化功能、壽命和繁殖能力為指標，評估威尼斯不動桿菌（Av）的致病性，說明秀麗隱桿線蟲可以作為致病性評價體系的篩選方案。有研究利用線蟲（N2 strain）建立了糞腸球菌持久感染模型[14-16]，并用其研究金黃色葡萄球菌的關鍵致病因子。線蟲還可作為抗衰老領域研究的動物模型，王麗萍等[17]發現，其自主設計合成的新型模擬酶-抗壞血酸過氧化物酶（DhHP-6）可延長野生型線蟲的平均壽命。秀麗隱桿線蟲因為是具有高度保守性的簡單多細胞真核生物，可以用于細胞凋亡的深入研究[18]。Kokel等[19]發現含萘的環境可以阻止線蟲體內部分細胞的凋亡，這種現象在缺少凋亡酶-胱天蛋白酶的情況下更加明顯。秀麗隱桿線蟲也是研究發育生物學和神經生物學的理想模型動物。在帕金森病的研究中，有學者在研究多巴胺能神經元損傷時，用化學藥物誘導秀麗隱桿線蟲制作轉基因模型[20]。此外，秀麗隱桿線蟲還可用于中藥活性及毒性的評價，以壽命、體長、運動行為、產卵率等為指標，魏巍等[21]發現蓖麻水提物可以使線蟲的生殖能力降低或喪失，許云等[22]發現芫花素可以抑制線蟲的運動行為，對其有一定的毒性。基于上述優勢，線蟲在測試環境生態毒性、篩選藥物、研究人類疾病、評價中藥毒性等方面得到廣泛應用。

前期研究用秀麗隱桿線蟲評價了黃連的毒性效應，發現黃連水提取物對線蟲有較為強烈的毒性，本研究則通過測定不同質量濃度的黃連-吳茱萸不同比例配伍提取物對線蟲的死亡率、體長和運動行為的影響，探究黃連、吳茱萸反佐配伍的減毒效果，為黃連、吳茱萸的臨床使用提供實驗依據，為使用線蟲快速評價中藥的不良反應方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 野生型N2秀麗隱桿線蟲（C.elegans of Wild-type Strain）于20 ℃生化培養箱中培養、大腸桿菌OP50于4 ℃冰箱中保存，均由中國科學院遺傳與發育生物學研究所提供。

1.1.2 藥物 黃連（北京市雙橋燕京中藥飲片廠，批號：1604034），經北京中醫藥大學中藥學院楊瑤珺教授鑒定為毛茛科黃連屬植物黃連Coptis chinensis Franch.干燥根莖。吳茱萸（安徽益生源藥業有限公司，批號：17090470），經北京中醫藥大學中藥學院楊瑤珺教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果實。

1.1.3 試劑與儀器 瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20200518）、蛋白胨（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20181206）、胰蛋白胨（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20180206）、膽固醇（北京博奧拓達科技有限公司，批號：160612）、酵母粉（賽默飛世爾科技公司，美國，批號：1149159）、氯化鈉（北京化工廠，批號：20160105）、磷酸二氫鉀（北京化工廠，批號：20190516）、氫氧化鉀（北京化工廠，批號：20161124）、硫酸鎂（北京化工廠，批號：20150317）、氯化鈣（北京化工廠，批號：20160808）、十二水合磷酸氫二鈉（北京化工廠，批號：20160216）、氯化銨（北京化工廠，批號：20150929）等均為分析純。

千分之一電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司，型號：BSA224S）、立式高壓蒸汽滅菌器（上海云泰儀器儀表有限公司，型號：LT-CPS50C）、恒溫水浴鍋（余姚市上通溫控儀器廠，型號：HHS11S）、超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：SB25-12DTD）、微量移液器（Eppendorf公司，型號：K36113B）、生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司，型號：LRH-150）、體式顯微鏡（上海尼康儀器有限公司，型號：SMZ800N）。

1.2 方法

1.2.1 黃連-吳茱萸水提物的制備 準確稱取黃連、吳茱萸共12 g，粉碎后加6倍量水（72 mL）在200 mL燒瓶內水浴回流1.5 h，濾過，藥渣再加4倍水（48 mL），回流1 h，濾過，合并兩次濾液，水浴蒸干，濾過，得到黃連-吳茱萸水提液，加熱揮干，得到黃連吳茱萸水提物，使用時用大腸桿菌溶液配成所需濃度。黃連-吳茱萸配伍比例見表2。

1.2.2 培養基及緩沖液的配制 LB液體培養基、線蟲生長培養基（NGM培養基）和M9緩沖液的配方見表3。

1.2.3 線蟲的基本培養 將秀麗隱桿線蟲放于NGM培養基上，投喂大腸桿菌OP50，在22 ℃恒溫培養箱培育。為保證線蟲的生活空間和食物充足，每3 d轉板1次，并保持培養基潔凈[23]。

1.2.4 線蟲的同步化處理 準備一個新的NGM培養基，涂布20 μL新鮮食物菌OP50，挑取60條左右產卵期的成蟲于新培養基上，約2 h后挑走全部成蟲，余下留有蟲卵的培養基，在22 ℃無菌生化培養箱中培養2 d，得到同步化處于L4時期的線蟲[24]。

1.2.5 線蟲存活率的測定 在涂有0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL不同比例配伍黃連-吳茱萸水提物的NGM培養基中分別放置30條同步化的處于L4時期的線蟲，22 ℃下培養。因為給藥期間線蟲會產卵，所以每隔24 h將存活的給藥線蟲挑到新的含相同藥物質量濃度的培養板上繼續培養，避免與新生幼蟲混雜。每天在相同時間觀察并記錄線蟲死亡的數目，當線蟲停止運動，觸碰沒有反應時即認為死亡，記錄最后一條線蟲的死亡時間為最長壽命[25]。

1.2.6 線蟲體長測定 在NGM培養基上涂布0.5 mg/mL不同比例配伍的黃連-吳茱萸水提物溶液配制的大腸桿菌OP50，使L4時期線蟲暴露在中24 h后，將培養基放在50 ℃烘箱中處理5～10 min，待線蟲全部死亡后，顯微鏡下進行圖像采集，利用Image J軟件進行圖像分析，測量線蟲虛擬體長。

1.2.7 線蟲頭部擺動頻率測定 L4時期線蟲經過在0.5 mg/mL不同比例配伍的黃連-吳茱萸水提物中暴露24 h后，在未添加大腸桿菌OP50的NGM培養基上放置30條線蟲，滴加緩沖液，記錄60 s線蟲頭部擺動的次數（將線蟲頭部從左擺到右邊再回到左邊記為一次擺動）[26]。

1.2.8 線蟲身體彎曲頻率測定 L4時期線蟲經過在0.5 mg/mL不同比例配伍的黃連-吳茱萸水提物中暴露24 h后，在未添加大腸桿菌OP50的NGM培養基上放置30條線蟲，滴加緩沖液，記錄20 s線蟲身體彎曲的次數（認為線蟲相對于身體的長軸移動一個正弦周期的波長為1次身體彎曲）[27]。

1.3 統計學方法 所有實驗平行重復3次，采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，其中計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃連吳茱萸不同比例不同濃度水提物對線蟲存活率的影響 不同培養時間下，0.5 mg/mL黃連-吳茱萸水提物不同配伍比例組對線蟲存活率的影響。見圖1。

不同培養時間下，1.0 mg/mL黃連-吳茱萸水提物不同配伍比例組對線蟲存活率的影響結果見圖2。

不同培養時間下，2.0 mg/mL黃連-吳茱萸水提物不同配伍比例組對線蟲存活率的影響結果見圖3。

以生品黃連為對照，不同濃度黃連-吳茱萸水提物對線蟲死亡率的影響為2.0 mg/mL<1.0 mg/mL<0.5 mg/mL，2.0 mg/mL組延長線蟲壽命最為顯著。每個濃度下，不同比例配伍黃連-吳茱萸對線蟲死亡率隨吳茱萸相對比例的增加而降低，說明吳茱萸能夠抑制黃連的毒性，使線蟲壽命增加。

2.2 黃連吳茱萸不同比例水提物對線蟲身體發育的影響 在之前的研究中發現，黃連水提物對秀麗隱桿線蟲具有明顯的毒性作用，能使線蟲的壽命、體長、頭部擺動頻率和身體彎曲頻率顯著降低，且隨濃度增加，毒性作用增強。為防止毒性過大影響實驗，選用0.5 mg/mL濃度組進行體長和運動行為實驗。見圖4。對照組生品黃連線蟲體長為（291.2±5.381），黃連-吳茱萸不同比例配伍水提物組線蟲體長分別為6∶1組（242.6±5.921）、5∶2組（249.2±5.048）、2∶1組（252.6±5.499）、3∶2組（248.5±4.301）、1∶1組（250.5±6.329）、1∶2組（255.5±5.960）、吳茱萸組（229.3±4.706）。與對照組比較，各組線蟲體長均極顯著減小（P<0.000 1），吳茱萸相對比例和線蟲體長之間無明顯線性關系。說明吳茱萸對黃連抑制的毒性有關。

2.3 黃連吳茱萸不同比例水提物對線蟲運動行為的影響 神經系統是對運動行為調節起主導作用的系統，因此可用線蟲頭部擺動和身體彎曲情況反映運動行為的好壞，從而衡量神經系統的基本功能，此種方法廣泛應用于評價藥物的神經毒性、有機化合物的毒性以及環境污染情況等。見圖5～6。生品黃連組線蟲頭部每分鐘擺動頻率為（101.3±3.395）次，身體彎曲頻率為每20秒（35.8±1.337）次;與生品黃連組比較，6∶1、5∶2組線蟲的頭部擺動頻率的差異無統計學意義（P>0.05），2∶1、1∶1組的頭部擺動頻率顯著降低（P<0.01），3∶2、1∶2和吳茱萸組的頭部擺動頻率極顯著降低（P<0.000 1）;6∶1、5∶2、1∶2組線蟲的身體彎曲頻率與生品黃連組比較，差異無統計學意義（P>0.05），2∶1、1∶1組的身體彎曲頻率顯著降低（P<0.01），3∶2和吳茱萸組的身體彎曲頻率極顯著降低（P<0.000 1）。說明吳茱萸不能緩解黃連對線蟲神經系統的抑制作用。

3 討論

秀麗隱桿線蟲是一種多細胞真核生物，經過科學家長期大量的研究，已知線蟲的生命周期、細胞譜系、基因組序列等，且因為其生命周期短、易于培養等優勢，可實現快速、高通量的化學品篩選[30]。與其他模式生物比較，雌雄同體的線蟲自體受精能產生非常純合的基因型，可以避免個體差異，再加上秀麗隱桿線蟲可以很好地代替嚙齒類動物進行毒性試驗，在預實驗時使用更加經濟，減少哺乳類實驗動物的消耗，符合3R原則，保證動物福利，因此廣泛用于藥物初步毒性評價及活性篩選，能夠更加準確、快速地評價中藥的生物毒性，闡明中藥毒性的作用機制，可用于建立規范的毒性評價系統[31-32]。

黃連性味苦、寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。吳茱萸性味辛、苦、熱，有小毒，歸肝、脾、胃、腎經，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效。黃連與吳茱萸的配伍，屬于寒熱配對，二者一寒一熱，一苦一辛，一降一升，一陰一陽，相反相成，互為母子（五行）[28-29]，雖僅兩味藥，但應用非常廣泛。本研究發現吳茱萸在一定程度上能夠降低黃連對秀麗隱桿線蟲的毒性，延長其壽命，而在生長發育和神經方面影響較小。黃連-吳茱萸配伍主要導致二者化學成分的溶出率增加或降低或生成新化合物，其中黃連生物堿溶出率隨黃連比例增加而降低，吳茱萸脂溶性生物堿溶出率隨黃連比例增加而升高[33]。推測黃連生物堿可能是降低線蟲壽命的主要成分，因此當其溶出率下降后會使線蟲壽命延長。吳茱萸有小毒，還能促進黃連生物堿在小腸部位的吸收[34]，這2個因素可能是造成吳茱萸降低黃連對線蟲發育和神經毒性不明顯的原因，需要進一步研究黃連、吳茱萸毒性作用的機制和配伍的機制。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：171-172，303-304.

[2]蓋曉紅，劉素香，任濤，等.黃連的化學成分及藥理作用研究進展[J].中草藥，2018，49（20）：4919-4927.

[3]董立，王莉，叢紹強.黃連、吳茱萸主要化學成份的消化系統作用機制研究進展[J].社區醫學雜志，2006，4（3）：38-40.

[4]張晟瑞.吳茱萸不同炮制品對肝臟毒性的影響及其減毒機制研究[D].南寧：廣西中醫藥大學，2017.

[5]趙楠，李達翃，李占林，等.吳茱萸化學成分的分離與鑒定[J].沈陽藥科大學學報，2016，33（2）：103-109.

[6]董立，石海蓮，季光，等.黃連吳茱萸藥對水提物對大鼠結腸癌癌前病變的作用[J].中國中藥雜志，2010，35（9）：1185-1188.

[7]許雅萍，顏永潮.中藥配伍的藥理作用淺析[J].中國中醫藥信息雜志，1998，5（7）：7.

[8]王靜，林晶晶，沈濤，等.黃連吳茱萸配伍研究述評[J].遼寧中醫雜志，2015，42（11）：2242-2245.

[9]王馨苑，黃夏冰，鄧鑫.基于網絡藥理學和分子對接探討黃連素治療2型糖尿病機制研究[J].中國新藥雜志，2020，29（24）：2820-2831.

[10]嚴歡，楊謹瑜，李月，等.黃連對小鼠肝臟毒性病理組織學觀察[J].中獸醫醫藥雜志，2017，36（5）：36-38.

[11]孫晨，韓利文，何秋霞，等.阿司咪唑對斑馬魚心臟毒性的影響及其分子機制的研究[J].中國現代醫生，2017，55（24）：41-45，169.

[12]冀嬌嬌，袁將，張亞麗，等.秀麗隱桿線蟲模型在中藥活性篩選中的方法學考察[J].長春中醫藥大學學報，2017，33（2）：223-225.

[13]李煜，王雪巖，胡曉珂，等.秀麗隱桿線蟲模型評估威尼斯不動桿菌的致病性[J].預防醫學，2019，31（11）：1086-1090.

[14]Garsin DA，Sifri CD，Mylonakis E，et a1.A simple model host for identifying Gram-positive virulence hctom[J].Proc Natl Acad Sci，2001，98（19）：10892-10897.

[15]1razoqui JE，Troemel ER，Feinbaum RL，et a1.Distinct pathogenesis and host responses during infection of C.elegans by P.aeruginosa and S.aureus[J].PLo S Pathogens，2010，6（7）：1-24.

[16]Sifri CD，Begun J.Ausubel FM，et a1.Caenorhabditis elegans as a model host for Staphylococcus aureus pathogenesis[J].Infect Immun，2003，71（4）：2208-2217.

[17]王麗萍，金鑫，黃磊，等.DhHP-6延長秀麗線蟲壽命的作用機制[J].吉林大學學報：理學版，2012，50（5）：1045-1048.

[18]杜方舟.利用線蟲模型研究紫娟普洱茶抗阿爾茲海默病的作用機制[D].長春：吉林大學，2017.

[19]Kokel D，Li Y，Qin J，et al.The nongenotoxic carcinogens naphthalene and pare-dichlorobenzene suppress apoptosis in caenorhabditis elegans[J].Nat Chem Biol，2006，2（6）：338-345.

[20]李煜，敬海明，李國君.秀麗隱桿線蟲神經毒理學研究進展[J].中國公共衛生，2013，29（4）：622-624.

[21]魏巍，王昌祿，王玉榮，等.以秀麗線蟲為模式生物評價蓖麻堿毒性的研究[J].氨基酸和生物資源，2012，34（1）：54-56.

[22]許云，阮秦莉，紀蕾蕾，等.芫花素對模式生物秀麗隱桿線蟲的毒性作用[J].中國藥理學與毒理學雜志，2017，31（5）：414-421.

[23]袁將.秀麗隱桿線蟲模型在藥物篩選、代謝和作用機制中的研究[D].北京：北京中醫藥大學，2018.

[24]魏燾，曾敏，李珂，等.以秀麗隱桿線蟲為模式生物的藍莓果酒抗氧化及抗衰研究[J].食品與機械，2016，32（5）：16-19，33.

[25]苗祥貞，張瀟，袁炎炎，等.黃連水提物對秀麗隱桿線蟲毒性效應評價[J].中草藥，2018，49（4）：874-878.

[26]韓焱，楊慧敏，宋少娟，等.馬拉硫磷對秀麗隱桿線蟲的急性毒性研究[J].山西大學學報：自然科學版，2012，35（3）：563-567.

[27]孫亞奇，盧錫林，蘇鳳娟，等.帕金森病基因α-Synuclein過表達對秀麗隱桿線蟲毒性作用的研究[J].新醫學，2013，44（4）：273-277.

[28]朱高峰，陳瑞，張倚鳴，等.黃連素衍生物WZX20在大鼠體內的藥動學研究[J].中國新藥雜志，2021，30（18）：1703-1708.

[29]楊威，金香蘭，于友華，等.黃連與吳茱萸配伍比例與功能關系的相關性分析[J].中國中醫基礎醫學雜志，2003，9（11）：49-50，83.

[30]劉東玲，支德娟，白彥麗，等.秀麗隱桿線蟲作為Ras/MAPK信號通路的抗腫瘤藥物篩選模型研究[J].甘肅中醫藥大學學報，2018，35（2）：1-5.

[31]鄧瑛，馬玲，高珊，等.模式生物線蟲在化學品快速高通量毒性篩檢評價中的應用[J].毒理學雜志，2012，26（4）：301-304.

[32]宮毓靜，范斌，陳巖，等.一種可用于中藥抗感染研究的桿狀線蟲整體生物模型[J].中國實驗方劑學雜志，2009，15（4）：87-90.

[33]涂瑤生，劉法錦，孫冬梅，等.黃連、吳茱萸配伍藥對的HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2011，33（1）：5-9.

[34]孫萬晶，張玉杰，姚南，等.黃連吳茱萸藥對配伍變化對黃連生物堿煎出及其對大鼠小腸吸收的影響[J].中國中藥雜志，2008（22）：2614-2616.

（2020-07-05收稿 責任編輯：吳珊）