黃羊源性成分檢測方法的研究

王伊琴 陳少博 楊 帆 包勇敢 荊文魁 常 鴻 康曉平

(1.二連海關技術中心，二連浩特，011100；2.呼和浩特海關，呼和浩特，010010；3.軍事科學院軍事醫學研究院微生物流行病研究所，北京，010071)

野生動物是大自然的產物，世界各國對珍貴、瀕危的野生動物實行重點保護。黃羊(Procapragutturosa)是我國Ⅱ級保護野生動物，中國瀕危動物紅皮書瀕危物種，主要分布于蒙古國的東部草原，中國的呼倫貝爾盟、錫林郭勒盟、烏蘭察布盟，并集中分布在兩國的邊境地帶。棲息于半干旱的草原，草食性，性喜群棲，集群的時間比較長，移動的距離和范圍也大，一般在春季和秋季進行大規模遷移，同時黃羊也受國際公約保護遷徙野生動物保護公約的保護[1]。20世紀70年代，內蒙古草原有野生黃羊300多萬頭，八九十年代，內蒙古還有野生黃羊100萬頭左右。最近20年來，由于盜獵分子的瘋狂獵殺，目前估計整個內蒙古只有幾千只[2-3]。每年冬季蒙古國大量黃羊越境到中國過冬，過冬之后又返回蒙古國，據統計僅2015年12月9日，有近600只黃羊通過二連浩特進入中國境內，為保護好這批野生黃羊，有關部門日夜堅守，密切關注野生黃羊群動向，確保野生黃羊在中國境內的安全。但是，在蒙古國和中國部分地區存在以獵捕野生黃羊為樂、以獵捕野生黃羊販賣謀取利益，使野生黃羊資源遭到嚴重的破壞[4-5]。又因為蒙古國是口蹄疫、小反芻獸疫的疫區，由于黃羊肉可食用，黃羊角可入藥，通過黃羊攜帶疫病、疫情傳入我國的風險日益增加，時刻威脅我國公共衛生安全。這就要求我們加強保護野生動物標準體系的建設，在進出口動物及其制品中準確甄別動物源性，確保世界遷徙野生動物受到保護，維護公共生物安全體系，從源頭上打擊走私販賣行為，黃羊源性成分的快速、靈敏、準確的檢測技術研究，為保護我國瀕危野生動物資源，為海關緝私執法提供了強有力的技術保障。

目前，黃羊源性成分的檢測技術的研究尚未見有相關的報道，本研究通過對黃羊的組織分別進行PCR和Real-time PCR檢測，分別進行了特異性、靈敏性和穩定性試驗，結果表明2種技術均能滿足日常的動物源性成分的檢測要求，為保證準確甄別源性成分提供了強有力的技術保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

基因組DNA提取試劑盒購于Bio Dev-Tech公司，DNA凝膠回收試劑盒及pGEM-T Easy載體購于Promega公司；Taqplus DNA聚合酶、限制性內切酶EcoR I 及DNA Marker 為TaKaRa 公司產品；大腸桿菌感受態細胞購于Trans Gene Biotech公司，其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 樣品

本試驗是在無菌條件下采取了6份健康黃羊的皮毛、肉等組織樣品。

1.2 方法

1.2.1 引物

根據GenBank中已發表序列(DQ266332.1)，應用Primer Premier 5.0設計特異性引物，針對黃羊線粒體基因設計引物序列如下：

由上海生工合成。

上游引物：5′-CTAGGCAACATGCATATC-3′；

下游引物：5′-CGAGAAGAGAAATCCTTG-3′。

探針：5′-FAM-CACGAGCTTAATGACCATGCCG-TA MRA-3′。

1.2.2 陽性質粒的制備和酶切鑒定

利用本試驗所設計的引物，黃羊DNA進行PCR擴增，將PCR產物利用膠回收試劑盒進行回收和純化，純化后PCR擴增產物與pGEM-T easy vector進行連接，4℃水浴過夜。將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5α，涂布于含有氨芐青霉素，X-gal和IPTG的LB瓊脂平板，于37℃溫箱中倒置培養20 h，隨機挑取白色菌落進行篩選。挑取單個菌落接種于含氨芐青霉素的LB 培養液中，37℃振蕩培養過夜。利用質粒提取試劑盒制備質粒，然后對其進行酶切和PCR鑒定，同時并送至上海生工公司進行測序分析。

1.2.3 普通PCR的擴增

該引物擴增了94 bp核苷酸。基因組總DNA的提取按試劑盒方法進行。PCR反應在25 μL體系中進行，其中含有：基因組DNA 200 ng，引物0.5 μM，dNTP 200 μM，Taqplus DNA Polymerase(5 U/μL)0.5 μL，0.1M10×Ammonium Buffer，ddH2O 17 μL，進行PCR擴增，循環條件如下。

94℃預變性5 min，94℃變性30 s，61℃退火40 s，72℃延伸40 s，共循環36次，最后于72℃延伸8 min。

1.2.4 Real-time PCR反應

PCR擴增體系25 μL：Premix ExTaqTM12.5 μL，上下游引物、探針(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 7.5 μL。

擴增條件：94℃預變性10 min，94℃變性15 s，58℃退火，延伸1 min，40個循環，58℃收集熒光。

1.3 PCR和Real-time PCR的特異性試驗

以同種方法提取等量的黃羊、牛(Bos)、羊(Caprinae)、馬(Equuscaballus)、豬(Sus)、鼠(Rattus)、雞(chicken)DNA和水(空白對照)為模版，分別進行PCR和Real-time PCR檢測，檢測其特異性。

1.4 PCR和Real-time PCR的靈敏性試驗

黃羊陽性質粒濃度(97.3 μg/mL)為模板，對該陽性質粒進行 10 倍系列稀釋，取6個梯度的DNA濃度，分別進行PCR及Real-time PCR擴增，檢測反應的靈敏性，并以其對應的拷貝數的對數與Ct值做標準曲線，評價其靈敏性。

1.5 Real-time PCR穩定性試驗

黃羊陽性質粒濃度(97.3 μg/mL)為模板，做10倍系列稀釋，取10-1—10-5倍比稀釋的5個梯度的DNA模板進行重復性試驗，每次試驗設3次重復，共進行3次試驗，計算組內和組間Ct值的變異系數。

2 結果

2.1 樣品的DNA濃度及純度

所提取樣品的DNA 濃度在20.8—244 ng/μL范圍內，A260/280在1.8—2.0間，完全可滿足PCR和Real-time PCR 檢測的要求。

2.2 普通PCR擴增、克隆和酶切鑒定

PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶大小與擴增片段基本一致約為94 bp(圖1)，初步證實為黃羊的目的基因。PCR 產物純化后克隆到載體中，轉化后挑取陽性菌落，經EcoR I 酶切可獲得3 000 bp和94 bp左右2個條帶，(pGEM-T Easy 載體兩端分別存在1個EcoRⅠ酶切位點)，這與載體和插入目的的片段大小正好相符(圖略)。同時應用上、下游引物在重組質粒中PCR 擴增出大小約為94 bp 的條帶，結果表明擴增片段已經插入載體中(圖1)。

2.3 普通PCR的特異性試驗

分別對黃羊、馬、牛、羊、豬、鼠、雞的DNA以及水(空白對照)進行擴增，以檢測方法的特異性。

2.4 普通PCR的靈敏性試驗

黃羊質粒DNA的濃度為97.3 ng/μL 。用ddH2O依次10倍稀釋7個梯度，即每個反應模板濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL，以確定方法對單一模板的靈敏度，該方法的靈敏度為0.1 ng/μL。

2.5 Real-time PCR的特異性試驗

用黃羊引物探針體系分別對黃羊、馬、牛、羊、豬、鼠、雞、水的DNA 進行擴增，由圖4可見，黃羊的DNA在Ct值為12.39時出現擴增曲線，其他動物組織和空白對照則沒有擴增曲線。

2.6 Real-time PCR的靈敏性試驗

圖5中曲線從左向右加入模板DNA濃度依次是100、10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1 ng/μL，對應的Ct值分別為13.24、17.77、20.07、24.56、28.06、31.65、36.12。Ct值<35的最大稀釋度溶液中的模板DNA含量為0.001 ng/μL，即為黃羊源性成分檢測的靈敏度。

以x軸代表質粒拷貝數的對數，y軸代表Ct值，繪制標準曲線圖6。

根據圖6標準曲線可知，當質粒濃度從100 ng/μL—10-4ng/μL 時，隨質粒稀釋度的增加，對應的Ct值也逐漸增大，且具有一定的線性關系。y=-3.7282 log 拷貝數+39.409，相關系數R2=0.996 6，說明在模板濃度范圍內都具有很好的線性關系，可以用于樣品的定量分析。

2.7 Real-time PCR的組內、組間穩定性試驗

2.7.1 組內穩定性試驗

如表1所示，模板DNA濃度10—0.001 ng/μL的5個倍比稀釋度內，每一稀釋度內做3個重復，Real-time PCR擴增反應的Ct值的標準差從0.06—0.60，變異系數0.314%—1.797%，圖7的擴增結果曲線也表明所建立的方法具有較好的組內穩定性。

表1 不同DNA濃度下組內、組間重復性試驗結果Tab.1 The results of intra and inter group repeatability tests at different DNA concentrations

2.7.2 組間穩定性試驗

如表1所示，模板DNA濃度10—0.001 ng/μL的5個倍比稀釋度內，每個稀釋度做一次試驗，共做3次試驗，Real-time PCR擴增反應的Ct值的標準差從0.15—3.32，變異系數0.671%—7.144%，圖8的擴增結果曲線也表明所建立的方法具有一定的組間穩定性。

3 討論

2013年歐洲爆發的馬肉風波，美國“沃爾瑪狐貍肉造假”事件，揭露了肉制品的摻假現象的嚴重性，引發了全球公眾對肉制品安全的擔憂[6]。我國食品風險監測已將肉制品的動物源性成分鑒定(牛、羊、豬、雞、鴨源性成分檢測)納入到常規監測中[7]。瀕危野生動物物種DNA鑒定技術是打擊肉制品摻假、走私，維護市場秩序，保護野生動物資源，提供了強有力的技術保障。

3.1 基于DNA 特異性序列分析方法建立的核心內容是選擇物種特異性DNA 靶序列。由于動物細胞存在2套基因組DNA，分別是線粒體基因組DNA 和核基因組DNA，因此，特異性DNA 靶序列選擇時存在2種可能，一種源于線粒體基因組DNA，另外一種源于核基因組DNA。目前，報道和應用的動物源性成分檢測方法大部分是針對線粒體基因組DNA 靶序列的，如12S RNA，16S RNA，18S RNA，Cybt序列等。此外越來越多的研究開始篩選核基因組DNA 特異性靶序列，如MC1R、LF、TRF、IL-2、β-actin、cGMP、BGH、cGMP、PDEs、RyR、MY等，并將其用于動物源性成分檢測[8]。

3.2 黃羊屬于洞角科(Bovidae)，其物種進化的同源性表明與牛的同源性大于98%，高于羊的同源性95%[9]，本研究PCR和Real-time PCR方法，對檢測的特異性分析結果，與牛、羊等未見有交叉擴增，均有很好的特異性。

3.3 本研究中的靈敏性特點分析，普通PCR法靈敏度分析，模板DNA靈敏度為0.1 ng/μL，較之孫艷華等[10]建立的普通 PCR 檢測熟肉肉類來源的方法檢測限為5%，本研究更具靈敏性，同時，普通 PCR 存在耗時長、產物易污染等不足[11]。

Real-time PCR方法靈敏度分析，模板DNA靈敏度0.001 ng/μL，較之Jonker 等[12]建立的檢測體系 50 pg/μL 更為靈敏，靈敏度線性相關系數R2=0.996 6，可以定量研究Ct值與拷貝數的關系。較之Wang等[13]建立的應用牦牛肉的方法體系0.001%相一致，與Fang等和Druml等[14-15]建立的方法體系，檢出限1 pg相同。總之，本研究所設計的黃羊引物、探針體系以線粒體細胞色素b基因為目的基因，Real-time PCR方法特異性、靈敏性、穩定性均優于普通PCR方法，而且可以量化分析，是探索動物源性成分檢測方法的優勢方法，其缺點是儀器設備要求高、價格高，對于基層檢測單位不利于滿足設備要求[16]。

3.4 組內、組間穩定性試驗研究分析，組內穩定性試驗研究中，模板DNA 0.001 ng/μL時，平均Ct值33.23，變異系數CV%為0.018，較模板濃度10—0.01 ng/μL的平均CV%0.004 3高了近1個數量級。組間穩定性試驗研究中，模板DNA 0.001 ng/μL時，Ct值32.49，變異系數CV%為0.071，較模板濃度10—0.01 ng/μL的平均CV%0.018高5倍。因此，根據穩定性的研究，組內CV%、組間CV%均小于25%，符合聯合國糧農組織(FAO)統一的檢測數據評價標準。并組內試驗的穩定性好于組間試驗。模板DNA稀釋度越高，Ct接近閾值35時，組內、組間穩定性試驗Ct值的SD越高，CV%大，試驗的穩定性也越差。

3.5 研究成果標準化后，應用推廣將對保障我國國境口岸野生動物物種鑒定發揮重要的作用，為保護瀕危野生動物資源，為海關緝私執法提供了強有力的技術保障。