越冬紅嘴鷗及棲息環境部分動物弓形蟲流行情況分析

董 路 何紫薇 程文杰 楊建發 代飛燕 鄒豐才 楊林富

(云南農業大學動物醫學院，昆明，650201)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)屬于球蟲亞綱，弓形體屬，是一種地域分布廣泛且宿主眾多的重要人獸共患寄生蟲，是能夠感染所有溫血和少數冷血動物的胞內寄生性原蟲[1]。鳥類(Aves)及幾乎所有的哺乳動物(Mammalia)，甚至一些水生動物都有可能成為弓形蟲的中間宿主[2]。弓形蟲也極易感染人(Homosapiens)，據調查顯示全球約有30%的人感染弓形蟲，我國人群平均陽性率為7.88%[3]。人可通過食入被弓形蟲卵囊或包囊污染的食物和水源感染弓形蟲[4]，或是長期與寵物糞便接觸或清潔不當也會導致感染。弓形蟲病的危害極大，可造成孕婦早產、流產和胎兒發育畸形等，也是免疫缺陷癥患者的主要死亡原因之一。同時該病對鳥類的感染會增加周圍人群感染弓形蟲的風險，尤其會給禽類養殖戶帶來嚴重的經濟損失，并且對生態環境也會造成潛在的危害。

紅嘴鷗(Chroicocephalusridibundus)是中國內陸及沿海地區最常見的中型候鳥之一，屬于鸻形目(Charadriiformes)鷗科(Laridae)鷗屬，因其嘴和腳皆呈紅色，故稱為紅嘴鷗[5-6]。紅嘴鷗屬“三有”保護動物。紅嘴鷗每年10月下旬，分別從新疆博斯騰湖、俄羅斯西伯利亞地區的貝加爾湖、蒙古國烏布蘇湖區域3條路線遷移至云南，次年3月再飛回北方[7]。遷徙至云南過冬的紅嘴鷗主要食取魚蝦(占進食量的95%)，昆蟲(4%)，植物性食物(1%)[8]。其在昆明比較集中的幾個棲息地即滇池、翠湖公園[9]、環西橋，玉溪撫仙湖等，其棲息環境正好是老鼠、流浪貓等動物的出沒頻繁之地，并且在滇池周邊村落還存在有散養雞飼養的情況，這幾種動物都是弓形蟲傳播的重要中間或終末宿主，這勢必為紅嘴鷗感染弓形蟲提供了條件。目前，關于滇池紅嘴鷗感染弓形蟲的相關報道仍較少。為了解遷入云南滇池越冬的紅嘴鷗弓形蟲感染情況，本調查選取滇池紅嘴鷗為主要研究對象，并對周邊紅嘴鷗棲息環境中的褐家鼠(Rattusnorvegicus)、散養土雞(Gallusgallusdomestiaus)等動物的弓形蟲感染情況進行調查研究。明確紅嘴鷗弓形蟲的感染時間和感染源，為遷徙候鳥弓形蟲病溯源、預防、診療等提供參考依據。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

于2017—2019年，從昆明滇池共采集到紅嘴鷗血液樣品403份，分離得到血清386份。此外，分別從玉溪市江川縣江城鎮、昆明市海口鎮和晉寧區晉城鎮、昆陽鎮采集周邊環境動物樣品162只，其中褐家鼠128只，散養土雞34只，解剖取其心、肝、肺、腎、腦、肌肉等組織樣品放置-20℃冰箱保存備用。

1.1.2 主要試劑

弓形蟲間接血凝實驗(IHA)試劑(購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所)、基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、dNTPs(購自大連寶生物工程有限公司)、2×TaqPCR Master Mix、rTaqDNA聚合酶等。

1.2 方法

1.2.1 間接血凝實驗(IHA)檢測紅嘴鷗弓形蟲抗體

在一次性96孔110°V型塑料反應板上進行弓形蟲抗體檢測，加樣前在反應板上做好樣品編號的標記，實驗操作和結果判定標準嚴格按照檢測說明書進行。

1.2.2 弓形蟲鏡檢觀察

將采回的褐家鼠、農戶散養土雞樣本進行解剖后，分別挑取腦組織充分研磨，加入少量生理鹽水。吸取約20 μL腦組織懸液滴涂在載玻片上，鏡檢觀察是否存在弓形蟲病原體。

1.2.3 巢式PCR檢測弓形蟲病原

1.2.3.1 全基因組DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書提取各動物全基因組DNA。并將提取的DNA 保存至-20℃備用。

1.2.3.2 巢式PCR擴增弓形蟲B1基因

擴增引物參照Alfonso等[10]所報道的B1基因引物序列，并優化其擴增體系和條件，預期擴增目的片段大小為530 bp，引物序列如下：

(1)外引物

B1-F1：5′-TGTTCTGTCCTATCGCAACG-3′

B1-R1：5′-ACGGATGCAGTTCCTTTCTG-3′

(2)內引物

B1-F2：5′-TCTTCCCAGACGTGGATTTC-3′

B1-R2：5′-CTCGACAATACGCTGCTTGA-3′

1.2.3.2.1 巢式PCR擴增體系及條件

在200 μL滅菌PCR管中依次加入滅菌ddH2O(第一輪、第二輪分別為9.5 μL、10.5 μL)、上游引物、下游引物各0.5 μL、2×TaqPCR Master Mix12.5 μL和模板DNA(第一輪、第二輪分別為2 μL、1 μL)，混勻后瞬時離心，PCR擴增反應總體系為25 μL。設立弓形蟲RH株DNA為陽性對照模板，ddH2O為陰性對照模板。兩輪PCR擴增程序參數為：94℃預變性5 min后進入循環，94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，共35個循環，最后72℃終延伸7 min。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，取凝膠塊置于紫外凝膠成像系統中觀察結果。

1.2.3.2.2 PCR產物測序及序列的比對分析

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子大小，選取條帶大小為530 bp左右的PCR產物送至生工進行測序。采用NCBI上的BLAST工具與數據庫中的核苷酸序列進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 紅嘴鷗IHA檢測結果

采用IHA弓形蟲血清抗體檢測試劑盒，共檢測滇池紅嘴鷗血清樣本386份。其中有44份血清檢測為弓形蟲抗體陽性，最高抗體效價為1∶512，總陽性率為11.40%。按遷徙時間分析，遷入3個月后(3月)陽性率略高于遷入時，為11.94%；按年齡分析，成年鷗陽性率最低，為10.73%，亞成鷗陽性率最高，為55.56%，幼鷗次之；按體重分析，體重小于250 g陽性率最低，為3.13%，體重在250—300 g的陽性率為最高，為10.94%，大于300 g的陽性率次之，為13.58%(表1)。

表1 滇池紅嘴鷗弓形蟲血清抗體檢測總結果Tab.1 Serum antibody test results of Toxoplasma gondii infection in black-headed gulls in Dianchi Lake

續表1

2.2 弓形蟲鏡檢觀察結果

分別取出褐家鼠、散養土雞完整腦組織研磨后作涂片，在顯微鏡下觀察。在1只昆陽褐家鼠腦組織中發現圓形包囊結構(圖1)。后經分子生物學鑒定為弓形蟲包囊，包囊內可以觀察到許多個密集的滋養體(緩殖子)。

2.3 巢式PCR檢測結果

2.3.1 弓形蟲B1基因檢測結果

本實驗PCR產物均擴增出大小約530 bp的目的片段，與預期目的條帶相符，且陰、陽性對照正常。經上海生工測序，測序結果顯示所擴增的目的DNA片段確定為弓形蟲序列。B1基因巢式PCR產物電泳圖見圖2。

2.3.2 紅嘴鷗弓形蟲感染情況

檢測結果顯示，紅嘴鷗弓形蟲感染率為3.23%，棲息環境中動物所有動物弓形蟲平均感染率為9.03%，其中褐家鼠感染率為17.19%，散養土雞為47.06%。有13只紅嘴鷗血液樣品檢測為陽性，紅嘴鷗棲息環境中，晉寧晉城鎮10只散養土雞弓形蟲感染率達100%，而江川江城鎮散養土雞感染率為0；晉寧兩鎮共22只褐家鼠檢測為弓形蟲陽性。陽性組織中心肝、肌肉組織檢出率最高(表2)。

表2 紅嘴鷗和棲息環境部分動物弓形蟲感染情況匯總Tab.2 Test results of PCR based on Toxoplasma gondii B1 gene in black-headed gulls and some of the animals in habitat environment

3 討論

3.1 紅嘴鷗弓形蟲流行情況分析

滇池流域由北向南共分布12個濕地，每年冬季都吸引了多種候鳥遷徙至此。據調查統計，滇池周邊濕地共聚集鳥類182種，主要由游禽、鳴禽和涉禽組成，其中紅嘴鷗數量最多(54.77%)，并圍繞整個滇池周邊濕地分布棲息[11]。Miao等[12]曾在2012—2013年，通過對滇池的659只紅嘴鷗調查研究發現，其中131只紅嘴鷗血清中檢測出弓形蟲抗體，陽性率為19.9%。李朝等[13]在2017—2018年，對186份紅嘴鷗血清樣本進行弓形蟲抗體檢測，結果顯示，弓形蟲抗體陽性率為11.29%，且年齡為主要感染風險因素。本調查結果顯示，滇池紅嘴鷗平均血清陽性率為11.40%，與Miao等[12](2013年)報道的結果相比有所降低，分析可能有以下原因：由于紅嘴鷗遷徙群體龐大，數量逐年增長，該調查采集的紅嘴鷗對象中未發現有佩戴腳環的紅嘴鷗，由此說明，與4年前采集的紅嘴鷗是同一批次的可能性極小。另一方面，可能由于氣候環境變化的影響以及紅嘴鷗有充足食物來源，使其自身免疫力提升，不易被感染。

3.2 紅嘴鷗棲息地動物弓形蟲流行情況分析

貓(Felis)、鼠(Rattus)是弓形蟲重要宿主，其在弓形蟲病的傳播中起到關鍵作用。20世紀70年代，研究者們通過抗體血清學調查發現世界各地區無論是家貓還是流浪貓以及野生貓科(Felidae)動物都有潛在弓形蟲感染現象[14-15]。農村貓的弓形蟲感染率為44.89%，城市貓的感染率19.64%[16]。Zhang和Yan等[17-18]在2014年研究發現，中國北部和東北部地區野老鼠弓形蟲感染率分別達到53.8%和23.6%。此外，雞是弓形蟲重要中間宿主之一，2010年Zhao等[19]對我國13個省共計1 173份雞血清樣品進行弓形蟲循環抗原(TCA)和抗體(TCAb)檢測，結果發現13個省的雞總血清陽性率為30.36%。本調查基于弓形蟲B1基因，對紅嘴鷗棲息地中褐家鼠和散養土雞感染情況調查發現，褐家鼠、散養土雞的感染率分別為17.19%、47.06%。紅嘴鷗感染率與弓形蟲宿主密切聯系。貓作為弓形蟲重要宿主，通過糞便排出孢子化卵囊，鼠作為中間攜帶者可被感染，雞、紅嘴鷗等禽類可通過地面覓食，攝入被貓糞便中弓形蟲卵囊污染的食物和水，從而增加了紅嘴鷗感染弓形蟲的幾率。

3.3 紅嘴鷗弓形蟲感染風險分析

自1985年紅嘴鷗首次大規模進入昆明主城區以后，每年都會有越來越多的紅嘴鷗如期抵達昆明越冬。紅嘴鷗屬于群體遷徙野生候鳥，主要感染時間發生在遷徙中和遷入后。年齡是主要感染風險內因素，亞成鳥的血清抗體陽性率顯著高于幼鳥和成鳥，原因可能是其處于生長發育的中間階段，對于食物的需求量大，通過食物感染弓形蟲的風險極大提高。此外，亞成鳥的機體體征處于變化較快的階段，長途遷徙過程中易受外界環境因素的影響。

環境條件也是紅嘴鷗感染的一個重要外因素。紅嘴鷗主要集中在滇池周邊公園、垃圾場和村寨等地覓食。而這些地方也是老鼠、貓出沒之地，靠近滇池周邊的村落還存在飼養散養雞的情況；該地區的水環境可能被貓糞便中的弓形蟲卵囊污染，因此大大增加了紅嘴鷗弓形蟲感染的風險。此外，被弓形蟲卵囊污染土壤也是紅嘴鷗感染弓形蟲的一個重要途徑。據調查顯示，昆明地區貓的糞便弓形蟲卵囊檢出率為4%[20]，Lélu等[21]研究表明，土壤中弓形蟲卵囊對于環境耐受性較高。翟凱等、杜芬等[22-24]研究發現公園、居民區等公共場所，奶牛場、豬場等養殖場地的土壤中均存在弓形蟲卵囊污染。其次，遷徙途中在濕地、淺灘等捕食水中已感染弓形蟲的小型蝸牛、魚蝦等也存在一定感染風險。弓形蟲的卵囊在水中至少可以存活6個月[25]，一些魚、貝類可作為弓形蟲傳播的載體從而濃縮水中弓形蟲卵囊。楊振[26]對中國部分地區水生生物弓形蟲檢測發現，克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)中有弓形蟲感染，陽性率0.65%，由此表明，水生生物在寄生蟲的轉寄作用上起到了關鍵作用。