基于COI和Cytb基因的黃腰響蜜系統發育分析和分歧時間估算

元青苗 段玉寶*

(1.西南林業大學，云南省高校極小種群野生動物保育重點實驗室，昆明，650224；2.西南林業大學生物多樣性保護學院，昆明，650224)

隨著分子生物學的發展，更多的鳥類(Aves)mtDNA基因全序列被測定[1]，線粒體基因組作為一種研究手段在揭示鳥類的起源、系統發生[2-3]、分歧時間的研究中發揮著重要作用[4-5]。在mtDNA的13個蛋白編碼基因中，COI和Cytb基因常用于動物類群的分類和系統發生關系的研究中[6-7]，具有良好的解析作用。

1 材料與方法

1.1 材料數據來源

用于研究的樣品采集于云南省西北部的瀘水縣高黎貢山，在此區域中獲得1只黃腰響蜜個體；取0.5 g左右的肌肉組織，采用無水乙醇進行浸泡，保存于西南林業大學生物多樣性保護學院。其余19個物種的COI和Cytb基因序列均來自于NCBI(National Center for Biotechnology Information)數據庫。其中，將犀鳥目(Bucerotiformes)作為外群[11]，共下載2條序列。每條COI和Cytb序列的長度分別大于650 bp和861 bp。物種信息詳見表1。

表1 本研究所需的物種基因序列信息Tab.1 List and gene information of species in this study

1.2 DNA的提取、擴增及測序

從采集的肌肉組織樣品中提取總線粒體DNA，DNA提取完成后加入100 μL ddH2O進行溶解，保存于-20℃的冰箱中。

線粒體基因組的引物和反應體系參照Sorenson等[12]的研究。DNA提取和PCR初步擴增完成后，經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察，然后將擴增成功的產物送往上海派森諾生物科技有限公司進行測序。黃腰響蜜的線粒體全基因組信息也已提交NCBI數據庫，登錄號為MH737741。

2 數據處理

2.1 序列處理

在MEGA 7軟件[13]中導入目標物種的序列，20條序列進行多重比對，比對好后對序列進行剪切，每條COI基因序列的最終長度均為650 bp，Cytb序列為861 bp。然后將比對剪切好的COI和Cytb序列分別整理成Fasta和Mega格式進行保存。

2.2 線粒體COI和Cytb基因的飽和性檢驗

運用DAMBE 5.2.63軟件[14]分析所有物種的序列飽和性。如果Iss與Iss.c滿足Iss

2.3 響蜜科鳥類種間遺傳距離計算

在MEGA7中，選用Kimura 2-parameter模型[15]計算響蜜科響蜜屬4種鳥類的種間遺傳距離。

2.4 系統發育樹的構建

使用貝葉斯法(bayesian inference，BI)[16]和最大似然法(maximum likelihood，ML)[16]建樹。在ClustalX 1.83軟件中轉換整理好的序列文件的格式，保留為Nexus和Phylip格式。

構建樹算法可以采用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(MCMC)算法提供所有樹的驗證頻率。最高的后驗概率樹是最優解，也是最優選擇的樹[17]。在jModelTest 0.1.1軟件[18]中算出核苷酸替代類型數(nst)、位點間速率分布(rates)等參數以及分析出研究系統發育關系最優的模型為GTR+I+G。MrBayes軟件是構建BI樹的常用軟件[19]，該軟件只支持貝葉斯法建樹，所以本文運用MrBayes v3.2.1構建BI樹。建樹時使用4個馬爾可夫鏈，外群則選擇棕犀鳥(Buceroshydrocorax)。運行后，共進行2次run，二者相互獨立，將起始的25%作為burn-in刪除。運行20萬代后，給出的標準誤差(sd)小于0.01，則運算結束。最后，在Figtree v1.2.2中查看生成的文件。

最大似然法建樹則是通過概率的計算進行的，ML系統發育樹可以利用MEGA7進行構建。

2.5 分歧年代評估

使用BEAST v2.5.2軟件[20-21]估算黃腰響蜜的分歧時間，此方法根據Jarvis等[11]依據鳥類化石記錄對多個目的分歧時間估算的結果作為校正點，啄木鳥目和佛法僧目(Coraciiformes)的分化時間約為43 Ma，犀鳥目的分化時間發生約為58 Ma。將 “*.nxs”格式的文件用于分析，采用松弛的分子鐘(relaxed clock log normal)模型，樹的先驗值計算選擇Yule Model模型，運行1 000萬代。使用Tracer v1.5評估結果的穩定性，之后再進一步分析，最終得到一個含有物種分歧時間的樹文件。可在Figtree v1.2.2中查看含有黃腰響蜜分化時間的文件。

3 結果與分析

3.1 基因序列飽和性分析

通過DAMBE 5.2.63軟件分析20個物種的核苷酸序列飽和性，導入Fasta格式的序列文件，COI序列分析結果顯示Iss=0.191 3

此外，為了更加直觀地看出核苷酸序列的飽和程度，做飽和度分析的散點圖(圖1A和圖1B)，橫坐標為F84遺傳距離；縱坐標為轉換Ts和顛換Tv數。圖1A顯示，當F84距離為0.330 8時，Ts與Tv并未相等，未出現飽和現象，則本研究所獲得的COI序列可以構建系統發育樹。同樣地，當F84距離為0.441 8時，Ts與Tv未相等，未出現飽和現象(圖1B)，則本研究所獲得的Cytb序列可以構建系統發育樹。

3.2 響蜜科鳥類種間遺傳距離分析

表2 基于COI基因的響蜜科鳥類遺傳距離Tab.2 Genetic distance between species of Indicatoridae based on COI

表2 基于COI基因的響蜜科鳥類遺傳距離Tab.2 Genetic distance between species of Indicatoridae based on COI

序號No.種名Species12341鱗喉響蜜Indicator variegatus2斑響蜜Indicator maculatus0.0213小響蜜Indicator exilis0.1120.0934黃腰響蜜Indicator xanthono-tus0.1200.1200.154

表3 基于Cytb基因的響蜜科鳥類遺傳距離Tab.3 Genetic distance between species of Indicatoridae based on Cytb

表3 基于Cytb基因的響蜜科鳥類遺傳距離Tab.3 Genetic distance between species of Indicatoridae based on Cytb

序號No.種名Species12341鱗喉響蜜Indicator variegatus2斑響蜜Indicator maculatus0.0323小響蜜Indicator exilis0.1320.1264黃腰響蜜Indicator xanthono-tus0.1770.1780.194

3.3 系統發育樹分析

利用COI(圖2A)和Cytb(圖2B)基因重建的BI和ML系統發育樹結構顯示出兩種基因構建的系統樹拓撲結構基本一致，具有相似的系統發育關系，以BI樹的拓撲結構作為展示。據圖顯示，黃腰響蜜與響蜜科響蜜屬聚為一大支(A：PP=0.99，BP=82；B：PP=1.00，BP=100)，與啄木鳥科互為姐妹群，并有較高的支持率(A：PP=0.97，BP=75；B：PP=0.96，BP=74)。在響蜜科內部，黃腰響蜜構成單系；在4種鳥類中，最早分化出來的類群是黃腰響蜜，其次是小響蜜(Indicatorexilis)。鱗喉響蜜(Indicatorvariegatus)與斑響蜜(Indicatormaculatus)聚為一支(A：PP=0.98，BP=91；B：PP=1.00，BP=100)。

3.4 分歧時間分析

Tracer v1.5軟件中顯示Ess值大于200，說明在BEAUti中設置的參數是合理的，最后得到含有物種分歧時間的樹文件。響蜜科鳥類的分化時間詳見圖3，可知響蜜科鳥類起源于新第三紀中新世時期，距今約20.44(15.88，25.77)Ma，而黃腰響蜜也在此時間段內分化出來(20.44 Ma)。此外，在漸新世和中新世階段，啄木鳥目鳥類的多樣性不斷擴大，物種多樣性越來越豐富。

4 討論

4.1 黃腰響蜜的系統發育分析

COI和Cytb基因片段序列被廣泛地應用于解決鳥類的分子系統發育問題[22]。本文的結果顯示，黃腰響蜜聚在響蜜科響蜜屬物種所在分支里，并且有著很高的支持率。黃腰響蜜所在的響蜜科與啄木鳥科有著姐妹群的關系，這與Prum等[23]的研究結果一致。而在響蜜科內部，黃腰響蜜是最早分化出來的物種，其次是小響蜜；且黃腰響蜜無姐妹群。

4.2 黃腰響蜜的起源分化

本研究分子定時的結果顯示啄木鳥科分化于14.95(14.02，15.89)Ma，與Prum等[23]的研究結果(Prum等研究表明啄木鳥科的分化時間約為15 Ma)相近，表明了分歧時間推斷的合理性和準確性，進而為評估黃腰響蜜的分歧時間提供支持。響蜜科鳥類的分化可追溯到新生代新第三紀中，黃腰響蜜在新第三紀中新世階段分化，時間節點為20.44(15.88，25.77)Ma。在這一時期，青藏高原發生了廣泛的隆起(22—20 Ma)，并隨著多個隆升事件[24-25]，直到3.4 Ma到1.6 Ma，高原抬升4 000 m以上，這被認為顯著影響了其形貌和鳥類物種的多樣化[26]。所以黃腰響蜜的形成可能與青藏高原隆起有關，其歷史和地理模式受到了青藏高原及周邊區域隆升的強烈影響。