貉流產死胎分離出致病大腸桿菌

劉勃興 趙安奇 劉 暢 王利麗 張雪佳吳同壘 高桂生 史秋梅 張志強

(河北科技師范學院，河北省預防獸醫學重點實驗室，秦皇島，066004)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是畜禽生產中的常見致病菌，不同類型的大腸桿菌所致發病癥狀存在差異。腸外致病性大腸桿菌可引起動物急性敗血癥、呼吸道炎癥以及泌尿道炎癥等[1]。毛皮動物也可感染大腸桿菌，主要表現為腹瀉、肺炎，嚴重可致敗血癥死亡。尤其是大腸桿菌性肺炎，近年來在毛皮動物養殖中十分常見，是造成毛皮動物死亡的最主要病原之一[2]。大腸桿菌感染還可引起懷孕母畜流產[3]。前期報道從多種動物流產胎兒分離出致病性大腸桿菌，揭示其可能是重要的致流產病原[4-7]。大腸桿菌感染引起毛皮動物流產鮮見報道，2015、2018年的2例報道首次從流產藍狐(Vulpeslagopus)和水貂(Mustelavison)胎兒體內分離大腸桿菌，懷疑其可能在毛皮動物上引發流產的致病原[4-5]。

春季是毛皮動物繁殖季節，也是流產的高發季節。在毛皮動物上能夠引起流產的病原主要有阿留申病毒、偽狂犬病毒、犬瘟熱病毒等病毒性病原以及加德納氏菌(Gardnerellavaginalis)、布氏桿菌(Brucella)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等細菌性病原。除此之外，附紅細胞體(Eperythrozoon)、旋毛蟲(Trichinellaspiralis)、蛔蟲(Ascarislumbricoides)等寄生蟲也可能引起流產[8-9]。多種病原均可導致毛皮動物流產，使臨床診斷流產原因難度增加，因此，大腸桿菌往往被忽略。

2019年5月接診到一起貉(Nyctereutesprocyonoides)流產病例，對其致病原進行檢測，結果未檢測到可致母貉出現流產癥狀的病毒、寄生蟲等病原。對流產胎兒肝臟、脾臟、心臟等臟器細菌進行分離鑒定，分離到1株能在血瓊脂平板上出現β溶血環的大腸桿菌，將分離菌株接種小鼠，證實其具有較強致病性，感染懷孕母鼠可致流產。進一步分析發現其致病和耐藥情況復雜。

1 材料與方法

1.1 材料

貉流產胎兒來自秦皇島市某發病貉養殖場送樣，無菌采取肝臟、脾臟、心臟等臟器。

1.2 主要試劑與儀器

營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、伊紅美藍培養基、麥康凱瓊脂培養基，均購自北京陸橋科技股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養基(羊血)，購自廣州迪景微生物科技有限公司；革蘭氏染色液，購自北京博奧拓達科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物科技股份有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條，購自法國梅里埃公司；D2000 plus DNA marker，購自中科瑞泰科技有限公司；E.coliO型診斷血清，購自天津生物芯片技術有限責任公司；2×TaqMaster Mix，細菌DNA基因組提取試劑盒，購自康為世紀生物科技有限公司。PCR儀器、瓊脂糖凝膠電泳成像儀、立式自動壓力蒸氣滅菌器、無菌工作臺、隔水式恒溫培養箱等，由河北科技師范學院/河北省預防獸醫學重點試驗室提供。PCR擴增引物合成和序列測定服務均由上海生工生物公司完成。

1.3 試驗動物

維通利華試驗動物有限公司。

1.4 病原菌的分離鑒定

1.4.1 病原菌的分離、鑒別培養與革蘭氏染色

用滅菌后棉簽無菌蘸取肝臟、心臟、脾臟等臟器樣品，接種于血瓊脂平板上，37℃恒溫培養12 h，挑取單個菌落接種于營養肉湯，37℃ 200 r/min恒溫搖床培養12 h。將分離菌分別在伊紅美藍培養基、麥康凱瓊脂培養基上分區劃線，37℃恒溫培養12 h后觀察菌落狀態。對分離菌進行革蘭氏染色，鏡檢。

1.4.2 生化特性鑒定

參考李文艷[10]的方法，用ID32E腸道菌鑒定試條對分離菌進行生化鑒定，并用ATB自動生化鑒定系統對結果進行判定。

1.4.3 分離菌的16S rDNA鑒定

用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA，并以其為模板，參考張志強等[11]的16S rDNA通用引物進行PCR，引物序列：16Sr-F(5′CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCATCATGGCTCAG-3′)；16Sr-R(5′-CAACAGAGTTTGATCATCATGGCTCAG-3′)。將PCR產物送上海生工生物公司測序，將測序結果拼接，用NCBI BLAST分析比對。

1.4.4 大腸桿菌血清型檢測

采用單因子血清玻片凝集法測定大腸桿菌的血清型，具體操作參照試劑說明書。

1.5 致病性試驗

試驗前參考文獻[10]處理母鼠使其懷孕。選取8周齡小鼠，公母各1只合籠。次日，觀察母鼠是否有陰門栓形成，若有，則判定為妊娠，繼續飼養6 d后挑選5只懷孕母鼠進行試驗。

參考李巧玲等[4]及張志強等[11]的攻毒劑量，進行致病性試驗。未懷孕組小鼠5只，每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌液(菌液濃度為1.0×108cfu/mL)，懷孕組母鼠5只，每只母鼠腹腔注射0.2 mL菌液(菌液濃度為1.0×104cfu/mL)。對照組未懷孕小鼠和懷孕母鼠各5只，每只小鼠腹腔注射0.2 mL無菌PBS。觀察并記錄每組小鼠狀態。

1.6 毒力基因檢測

以提取分離菌DNA為模板，用PCR方法檢測分離菌毒力基因攜帶情況。大腸桿菌毒力基因參考文獻[12](表1)，PCR反應程序退火溫度 58℃。

表1 毒力基因引物Tab.1 Virulence gene primers

續表1

1.7 藥物敏感性試驗

按照美國臨床和試驗室標準協會(CLSI)的標準，采用K-B藥敏紙片法對分離菌進行藥物敏感性試驗。試驗重復3次，取抑菌圈直徑平均值為最終結果。

1.8 耐藥基因檢測

參照1.4.3中的方法提取細菌基因組，用 PCR方法檢測分離菌耐藥基因。大腸桿菌耐藥基因引物(表2)及PCR反應程序參照文獻[13]。

表2 耐藥基因引物Tab.2 Drug resistance gene primers

續表2

2 結果與分析

2.1 細菌的分離鑒定

2.1.1 分離菌菌落形態與革蘭氏染色

分離菌在血瓊脂平板上培養，菌落有明顯β溶血環。在伊紅美藍培養基上培養，分離菌菌落呈紫黑色，有金屬光澤。在麥康凱瓊脂上培養，分離菌菌落呈紅色。對分離菌進行革蘭氏染色，鏡檢。鏡檢結果為革蘭氏染色陰性桿菌，兩端鈍圓。根據細菌菌落形態與革蘭氏染色鏡檢結果初步判定為大腸桿菌。

2.1.2 生化特性鑒定

用ID32E腸道菌鑒定試條對分離菌進行生化鑒定，并用ATB自動生化鑒定系統對結果進行判定，生化鑒定結果顯示：d-葡萄糖、賴氨酸脫羧酶、L-阿拉伯糖、d-甘露醇、肌醇、d-半乳糖酸鹽同化、d-海藻糖、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、d-麥芽糖、蔗糖、酚紅檢測結果為陽性，經ATB自動生化鑒定儀分析結果為大腸桿菌。

表3 LCE-1菌株生化鑒定結果Tab.3 Biochemical identification results of LCE-1 strain

2.1.3 分離菌16S rDNA鑒定

將分離菌用16S rDNA通用引物進行PCR檢測，將PCR產物送上海生工生物公司測序，將測序結果用NCBI BLAST進行序列比對，分離菌與大腸桿菌屬同源性最高。

從GenBank上下載大腸桿菌屬參考菌株以及腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的克雷伯菌屬(Klebsiella)、沙門菌屬(Salmonella)，以及巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)的巴氏桿菌屬(Pasteurella)參考菌株的16 S rDNA序列，用Lasergene軟件的Megalign功能進行序列分析和系統發育樹構建，發現分離菌與其他大腸桿菌屬參考菌株處于同一分支，與腸桿菌科的沙門參考菌株、克雷伯參考菌株屬于同一個大分支，而與巴氏桿菌科成員親近性相對較遠。

2.1.4 大腸桿菌血清型檢測

通過玻片凝集試驗檢測分離菌，結果顯示分離菌為O89血清型大腸桿菌。結合鑒定培養基培養、革蘭氏染色、生化鑒定、16S rDNA基因測序分析的試驗結果，判定分離菌為大腸桿菌，命名為LCE-1。

2.2 致病性試驗

將LCE-1菌以每只0.2 mL菌液(菌液濃度為1.0×108cfu/mL)的劑量感染未懷孕小鼠，24 h后LCE-1組小鼠全部死亡，對照組小鼠無死亡。對照組小鼠連續觀察2周，小鼠均無死亡，精神狀態良好，無任何病征。

將LCE-1菌以每只0.2 mL菌液(菌液濃度為1.0×104cfu/mL)感染懷孕母鼠，24 h后LCE-1組懷孕母鼠出現流產病征，精神萎靡。72 h后5只LCE-1組母鼠全部流產，并有1只母鼠死亡。對照組懷孕小鼠無變化。10 d后，對照組小鼠陸續正常分娩。

將死亡小鼠肝臟、脾臟、心臟，流產母鼠子宮細菌分離鑒定，同樣分離到大腸桿菌。

2.3 毒力基因檢測

采用用PCR對LCE-1菌的毒力基因進行檢測。結果顯示：vat、iroN、iucD、ECs3737、irp2、fyuA6種毒力基因檢測陽性。試驗數據表明LCE-1攜帶多種毒力基因，其致病性可能與這6種毒力基因有關。

2.4 藥物敏感性試驗

采用K-B紙片法對LCE-1菌株進行藥物敏感性試驗，試驗結果判定參照CLSI標準。試驗結果顯示：LCE-1對麥迪霉素、呋喃唑酮、苯唑西林、克林霉素、萬古霉素、紅霉素、米諾環素、多粘菌素B、丁胺卡那、復方新諾明、多西環素、氯霉素、卡那霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢呋辛、青霉素、四環素共19種藥物耐藥；對哌拉西林、頭孢唑林、頭孢哌酮、羧芐西林、頭孢曲松、新霉素6種藥表現中敏；對環丙沙星、頭孢他啶、氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星5種藥物表現敏感(表4)。其中，萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星為農業部公告的禁用獸藥，只用于試驗研究。分離菌的藥物敏感性試驗數據顯示，LCE-1菌多重耐藥性十分嚴重。

表4 藥敏試驗結果Tab.4 Drug sensitivity test results

2.5 耐藥基因檢測

用PCR對LCE-1菌的耐藥基因進行檢測。試驗結果顯示：四環素類(tetA、tetC、tetD)、β-內酰胺類藥(blaTEM、blaTEM1、blaOXA1)氨基糖苷類(aadA1、strA-strB)、磺胺類(sul1、sul2)耐藥基因檢測陽性。試驗數據顯示，LCE-1攜帶多種耐藥基因，進一步解釋了為何LCE-1多重耐藥情況如此嚴重。

3 討論

大腸桿菌為一種在自然條件下普遍存在的條件性致病菌，可感染多種家畜、家禽以及人類發病。動物感染大腸桿菌后常出現腹瀉、敗血癥、免疫力降低等癥狀。本研究在秦皇島某貉養殖場懷孕母貉流產病因進行診斷，對送檢流產胎兒進行病毒(阿留申病毒、偽狂犬病毒、犬瘟熱病毒)、寄生蟲(附紅細胞體、旋毛蟲、蛔蟲)、細菌(加德納氏菌、布氏桿菌、銅綠假單胞菌)檢測，結果均為陰性。但在肝臟、脾臟、心臟等臟器分離出1株優勢菌株，該菌株菌落在血瓊脂平板有明顯β溶血環。通過伊紅美藍、麥康凱鑒定培養基培養觀察菌落形，革蘭氏染色鏡檢觀察細菌形態初步判定為大腸桿菌。進一步進行細菌生化鑒定，16S rDNA 序列分析，大腸桿菌血清型檢測，最終結果判定為大腸桿菌，血清型為O89型，并命名為LCE-1。

本研究進一步對LCE-1的致病性進行研究。本研究將LCE-1以不同劑量分別感染未懷孕小鼠以及懷孕母鼠，發現該菌能導致未懷孕小鼠死亡，懷孕母鼠流產。剖檢死亡小鼠，發現其內臟器官出現嚴重的出血，并從死亡小鼠肝臟、脾臟和心臟，流產母鼠子宮內同樣分離到大腸桿菌。表明LCE-1是致小鼠死亡以及懷孕母鼠流產的病原。但LCE-1是否可致母貉流產還需進一步研究。前有報道從流產藍狐、水貂胎兒中分離到致病大腸桿菌，2004年趙傳芳等[14]從流產貉的子宮內膜分離到致病大腸桿菌，本研究從貉流產胎兒臟器分離出具有較強致病性大腸桿菌，表明在臨床診斷貉流產病時，大腸桿菌是不可忽略的重要病原。

大腸桿菌的致病性主要與其攜帶的毒力基因有關[15]，為了研究其致病原因，本研究初步對LCE-1大腸桿菌的毒力基因進行檢測，發現其攜帶有vat、iroN、iucD、ECs3737、irp2、fyuA毒力基因。Vat為空泡形成毒素基因，可導致宿主細胞空泡化；ECs3737為ETT2毒力島標志基因；iucD為氣桿菌素編碼基因，iroN為鐵結合性復合物內化的受體，irp2和fyuA為強毒力島(HPI)的編碼基因，這4個大腸毒力基因都可以影響機體鐵攝取，這可能是致病的主要因素。而大腸桿菌發揮致病作用為一個復雜的過程，空泡形成毒素基因Vat、ETT2毒力島基因與攝鐵系統的毒力基因的共同存在可能才是最終導致母畜流產的原因。但目前大腸桿菌致母畜流產的致病機制以及流產癥狀與毒力基因之間的關系尚不明確。

在不同的時間，不同的地區流行的大腸桿菌的血清型不同，其致病力也存在差異[16]。通過對LCE-1血清型鑒定，鑒定其為O89型大腸桿菌。O89型大腸桿菌為我國禽類致病大腸桿菌的流行型，在貉中分離出該血清型大腸桿菌可能為在飼料中添加有禽類產品或將人食用后的剩菜剩飯等飼喂貉所致，從而引起貉發病。

在臨床治療大腸桿菌病時，有時抗生素類藥物不能有效地控制住病情，但當前大腸桿菌病的防治還是以抗生素類藥物為主[17]。為了指導臨床用藥，本研究挑選30種臨床常見的藥物，發現LCE-1菌株對麥迪霉素、呋喃唑酮、苯唑西林等19種藥物耐藥，對哌拉西林、頭孢唑林、頭孢哌酮、羧芐西林、頭孢曲松、新霉素6種藥中敏，對環丙沙星、頭孢他啶、氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星5種藥敏感。本研究選取的30種藥物種，包括了獸醫臨床常用抗生素、農業部禁用抗生素以及人醫常用抗生素等，發現該大腸桿菌對19/30的藥物耐藥。胎兒在母體內并不能直接與藥物接觸，而從流產胎兒臟器中分離出的LCE-1菌株表現為多重耐藥，由此猜測LCE-1來自于母貉，并且通過胎盤垂直傳播給胎兒，但具體原因應進一步研究。細菌多重耐藥性的產生不僅給動物疾病的防治帶來了困難，而且還給食品安全以及人類健康也造成嚴重的威脅，應引起大家的重視[18]。

大腸桿菌的耐藥性主要是耐藥質粒通過接合、轉化、轉導等方式在不同菌株之間傳遞，使敏感菌成為耐藥菌[19]，而多種耐藥基因的存在是導致大腸桿菌多重耐藥性的主要原因。通過對LCE-1菌的四環素類等5種類藥物耐藥基因進行檢測發現，該菌攜帶有四環素類(tetA、tetC、tetD)、β-內酰胺類(blaTEM、blaTEM1、blaOXA1)氨基糖苷類(aadA1、strA-strB)、磺胺類(sul1、sul2)藥物的耐藥基因。進一步證實了大腸桿菌多重耐藥性的產生與耐藥基因的存在有著一定的關系。

毛皮動物養殖是秦皇島市的支柱產業，母畜流產可給養殖戶造成嚴重的經濟損失。在臨床診斷貉流產病例中，普遍認為大腸桿菌并非是導致流產的主要病原，因此缺乏對大腸桿菌的關注。本研究在貉流產死胎臟器分離出致病大腸桿菌，該株菌對小鼠具有較強致病性，可致懷孕小鼠流產，并具有嚴重的多重耐藥性。本研究揭示大腸桿菌可能為貉流產的病原，為該病的防控奠定基礎。