糖尿病腦病動物模型制備方法的研究進展

霍明軒，劉偉，王倩，馮波

濱州醫學院附屬醫院，山東濱州256600

糖尿病是一組以高血糖為主要特征的代謝性疾病，可引起糖尿病周圍神經病及中樞神經系統并發癥。研究發現，糖尿病與人類認知障礙有明顯相關性［1］，糖尿病腦病于1950年被DEJONG首次提出，總結了糖尿病的認知損害并發癥［2-3］，NIELON于1965年證實了糖尿病腦病這一概念，其臨床表現主要為學習、記憶能力減退和認知功能障礙，病理變化以神經電生理和影像學異常為主要特征［4-6］。研究發現，血糖水平異常可影響老年糖尿病患者的日常行為和情緒，糖代謝紊亂可能是晚發性阿爾茨海默病的始動因子，因此有學者提出阿爾茨海默病是3型糖尿病的學說［7］。隨著研究的深入，糖尿病腦病這一概念被逐漸完善，但糖尿病腦病的發病機制、預防與治療等尚待進一步研究。在做動物實驗之前，需要先制備出理想的糖尿病腦病動物模型。隨著研究的深入，近年已經取得一些成果，現綜述如下。

1 糖尿病腦病動物模型常規制備方法

制備糖尿病腦病動物模型，首先應該制備糖尿病動物模型，進行學習及認知功能評估，篩選出合適的糖尿病腦病動物模型。動物模型的選擇應符合以下基本原則：a.選用與實驗設計、實驗方法等相匹配的標準化等級動物；b.選用與人體結構功能、機能、代謝及疾病特征相似的動物；c.各種檢測指標易于施行；d.實驗動物易獲得、經濟、易飼養管理［8］。糖尿病動物模型按照制備方法不同，分為實驗性動物模型、自發性動物模型、基因工程動物模型。

1.1 實驗性動物模型實驗性糖尿病動物模型是指通過手術方法、化學試劑和高脂飲食等人工誘發的具有糖尿病特征的動物模型，具有價格便宜、方法簡便、易于誘導和維持的特點。

1.1.1 手術方法1889年，德國的MINKOWSKI最早通過切除犬胰腺，制備第一個糖尿病動物模型。全胰腺切除術誘發的糖尿病模型比較穩定，但胰島素缺乏可出現尿糖、高血糖和酮癥酸中毒，不治療動物將會死亡［9］。雖然全胰腺切除術是一類比較安全的手術，但存在十二指腸壞死并發癥可能，并且手術切除有造模繁瑣、術后感染等缺點，僅少數大動物適用，因此不宜選擇胰腺切除的方法制備糖尿病腦病動物模型。

1.1.2 單純高糖高脂飲食誘導法高糖高脂飲食可以誘發胰島素抵抗，該機制可能為營養過剩導致游離脂肪酸和氨基酸的增加直接導致胰島素抵抗［10］。特殊膳食誘導糖尿病模型首先由HOUSSAY和MARTINEZ在1947年報道。席守民等［11］給予貴州小香豬高脂高蔗糖（含10%豬油，37%蔗糖）飼料喂養，3個月后出現高脂血癥和高血糖癥，建立了較理想的2型糖尿病模型，但小香豬價格昂貴且造模時間較長，不適合作為糖尿病腦病動物模型。也有人用清潔級近交系雌性Wistar大鼠建立糖尿病模型，方法為用高糖高脂飼料（其中含20.0%蔗糖，10.0%豬油，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規飼料）飼養Wistar大鼠1個月，喂養1個月后24 h攝食量、體質量明顯增加，血清甘油三酯、膽固醇水平也升高明顯，血糖血脂水平均較常規飼料組高；并且計算獲得的胰島素敏感指數也高于對照組［12］，胰島素敏感指數與對照組相比有顯著性差異，從而成功建立了較理想的糖尿病動物模型。此種方法經濟、簡便易行，可作為糖尿病腦病動物模型的誘導方法［13-15］。

1.1.3 化學藥物誘導法鏈脲佐菌素（STZ）是一種抗菌及抗腫瘤藥物，由SZKUDELSKI等［16］1963年首次報告有致糖尿病作用，STZ通過葡萄糖轉運蛋白2（GLUT2）獨自進入某些種屬動物（大鼠、小鼠、猴、羊、狗等）的胰島β細胞，從而破壞胰腺β細胞，導致胰島素缺乏。KOLB等［17-18］在1976年首次通過單次靜脈或腹腔注射的方法，給予小鼠不同劑量的STZ，發現小劑量的STZ即可誘導出2型糖尿病。研究認為，同一種屬動物中STZ致細胞損傷程度取決于STZ劑量。一次性給予大鼠腹腔或靜脈注射STZ 40～90 mg/kg，可直接破壞胰島β細胞；也可注射STZ 15 mg/kg，一日3次，通過免疫機制（T淋巴細胞介導）使β細胞不斷破壞而導致糖尿病。給予成年大鼠注射少量STZ，使少量胰島β細胞受到破壞，最終引起血糖升高，且用STZ處理新生大鼠，最終導致2型糖尿病［19-20］。四氧嘧啶的作用除了抑制葡萄糖激酶、誘導活性氧簇，還可以通過破壞某些種屬動物胰島β細胞，最終導致糖尿病。有研究者曾用四氧嘧啶誘導清潔級ICR種小鼠制備糖尿病模型，但模型的制備受藥物劑量、藥物注射方法、小鼠性別、周齡、禁食時間等諸多因素影響，并且四氧嘧啶比STZ對肝腎組織造成的毒性更大，酮癥發生率也較高，因此我們建議不采用四氧嘧啶誘導法制備糖尿病模型［20-22］。有報道稱，聯合使用STZ（30 mg/kg）+四氧嘧啶（50 mg/kg）可以制備糖尿病動物模型，這種方法減少了每種試劑的劑量，降低了毒性，增加了造模成功率，并且因STZ的用量減少而降低了成本。但是該方法制備的模型更類似于人類1型糖尿病模型，所以不推薦用此方法制備糖尿病腦病模型［23］。

1.1.4 高糖高脂飲食聯合小劑量STZ法目前最常用的實驗性2型糖尿病動物模型建立方法是高糖高脂飲食聯合小劑量STZ。2型糖尿病是一種異質性疾病，其特征是胰島素作用（胰島素抵抗）逐漸減弱，隨后β細胞無法補償胰島素抵抗（胰腺β細胞功能障礙），導致葡萄糖穩態失衡，最后發展為糖尿病，其特征為中度高血糖、高血脂、胰島素抵抗［24-25］。因此先用高糖高脂飲食誘發胰島素抵抗，再通過注射STZ破壞胰腺β細胞，制備糖尿病動物模型。具體方法：選用清潔級Wistar大鼠/SD大鼠，以高糖高脂飼料喂養4周，有研究者又加用了果糖飲水，其中高糖高脂飼料配比各研究者使用不一，但致胰島素抵抗的目的相同。喂養4周后，一次性腹腔注射STZ（溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.4），STZ劑量在25～35 mg/kg。2周后大鼠空腹血糖明顯增高，符合糖尿病診斷標準，同時出現胰島素敏感性下降、胰島素抵抗及高胰島素血癥。此方法所建大鼠模型與人類2型糖尿病的疾病特點相似，造模成功率高，為我們提供了較理想的研究糖尿病腦病的模型［25-28］。

1.2 自發性動物模型自發性動物模型是指沒有經過人工干預，實驗動物在自然情況下發生糖尿病的模型，可以在很大程度上模擬人類糖尿病發生發展的過程，在基礎實驗中具有較大的臨床意義。自發性的2型糖尿病常用模型有GK大鼠、KKAy小鼠、Zucker大鼠、NSY小鼠、中國地鼠等［29］。有研究者已用KK-Ay小鼠作為模型研究糖尿病腦病［30］。但自發性動物模型因價格較昂貴，飼養條件要求嚴格，繁殖率低等缺點而限制其廣泛應用。

1.3 基因工程動物模型基因工程動物模型是指借助基因工程技術控制動物基因表達，使動物獲得特有的遺傳特性。其中2型糖尿病被認為是多基因異常疾病，目前已開發出多種轉基因或基因剔除小鼠糖尿病模型。用此模型做糖尿病科研科學性強，但技術復雜，目前國內尚無條件普遍開展［29］。

上述制備糖尿病動物模型的方法可導致腦內胰島素信號傳導障礙，通過上述方法制備2型糖尿病動物模型后，需要再次通過行為學實驗進行認知功能評估，篩選出有認知功能障礙的糖尿病動物模型即糖尿病腦病動物模型。

2 糖尿病腦病動物模型側腦室注射制備法

STZ在外周可以選擇性破壞胰島細胞，在中樞可以引起胰島素受體自身磷酸化和內在的酪氨酸激酶活性降低，導致胰島素信號傳導障礙［31-32］。研究表明，胰島素對神經細胞是一種神經營養因子，長時間缺乏會造成神經元退行性變，導致認知功能障礙［32-33］。因此有研究者用STZ側腦室注射的方法來制備糖尿病腦病模型。具體方法為：選用清潔級C57BL/6小鼠，經5%異氟醚麻醉，以氧氣為載體，術中維持在2%～3%。將小鼠固定于腦立體定位儀上，消毒皮膚，正中矢狀切口，分離骨膜，錐顱器鉆開顱骨，暴露硬腦膜，每側側腦室注射STZ 3 mg/kg各1.5μL，注射速度為0.5μL/min，術后常規飼養14 d，然后進行認知功能評估，即可獲得糖尿病腦病動物模型［34］。

3 糖尿病腦病動物模型的篩選方法

糖尿病腦病動物模型的篩選方法以Morris水迷宮實驗應用最為廣泛，其次還包括新物體識別實驗、抑制性回避任務等。研究表明，有60%～70%的糖尿病患者存在輕中度認知功能缺損，認知功能障礙表現為語言、記憶和復雜信息的處理能力下降，臨床主要表現為學習記憶功能減退［35］。

3.1 Morris水迷宮實驗Morris水迷宮由圓形的水池，可移動位置并隱藏在水面下的平臺、圖像自動采集處理系統組成。實驗對象為大鼠時，水迷宮直徑為160～180 cm，水池內水溫保持在（25±1）℃；為小鼠時，水迷宮直徑為100～120 cm，水溫保持在21～22℃。水迷宮高度均為50 cm，水中可適當加入牛奶或無毒染料，水池內壁被漆為黑色。迷宮上方安裝記錄動物模型運動軌跡的攝像機，池壁上以4個等距點將水池分為4個象限，在目標象限中心放有直徑為10 cm、高30 cm的表面粗糙平臺。實驗內容包括定位航行和空間探索，實驗第1天將鼠放入水池中自由游泳適應60～120 s，第2天起將平臺置于目標象限，面向池壁將動物放入水中，每日4次（4個不同的象限各一次），每次訓練時間60 s，每次間隔15 s，共訓練4～5 d，找到平臺后允許動物在平臺上滯留10 s并記錄逃避潛伏期（動物進入迷宮到找到平臺的時間），如果動物未在規定時間內找到平臺，則引導其在平臺上停留10 s，潛伏期記錄為60 s。定位航行結束后24 h，移除平臺，任選一點將鼠放入水中，記錄在規定時間內（60 s）第一次跨越平臺時間、跨越平臺次數等指標。此實驗應嚴格遵循操作程序及注意事項，以獲得可靠數據［36-38］。

3.2 新物體識別實驗ENNACEUR等［39］在1988年報道了用于檢測嚙齒類動物空間記憶能力的新事物與新位置識別實驗。具體方法為：將鼠放置在一個不透明的開放場室里，允許探索1 min以熟悉環境，然后放入家籠中1 min，此時將兩個相同的物體放入兩個相對的角落，再將鼠放置在開放場室，記錄3 min內探索兩個物體的時間。利用嚙齒類動物喜歡探索陌生事物的天性，間隔24 h后，將熟悉的物體與一個新的物體配對，再次將鼠置于開放場室，記錄3 min探索時間。其中每個步驟后均用60%酒精清洗盒子和物體，避免氣味痕跡干擾。最后用認知指數（RI）評價認知功能，RI的計算方法是將新目標探索時間除以總探索時間，RI值大于0.5表示動物喜歡探索新奇物體［36-40］。

3.3 抑制性回避任務抑制性回避任務需要準備一個由大小相同的亮室和暗室組成的回避裝置，兩室間由可移動的門連接。利用嚙齒類動物偏愛黑暗環境的天性，將大鼠放在亮室里，然后打開中間門，當大鼠由亮室完全進入暗室時，足部將會遭遇一次電擊。測試結束后24 h，再次將大鼠放入亮室進行同樣的測試，記錄大鼠從亮室進入暗室的時間（潛伏期），潛伏期越長，表示大鼠記憶越好［36］。

綜上所述，目前應用最多的糖尿病腦病模型為高糖高脂飲食聯合小劑量STZ的方法，另外，高糖高脂飲食誘發胰島素抵抗、小劑量STZ靜脈或腹腔注射選擇性破壞胰島β細胞等方法也可制備糖尿病腦病動物模型。若經濟條件及飼養條件允許，可以應用自發遺傳性動物；若手術條件允許，也可以采用側腦室注射STZ的方法。上述方法制備糖尿病動物后，再進行Morris水迷宮實驗、新物體識別實驗、抑制性回避任務等進行認知功能評估，篩選出糖尿病腦病動物模型。實驗動物是糖尿病腦病研究的基本條件及有力工具，至今為止，還沒有一種動物模型能夠完全模擬糖尿病腦病的發生及發展過程，實驗者應綜合各種因素，選擇最適合自己試驗的模型。