蘆筍提取物穩定性和緩解體力疲勞功能研究

鄭立新，蔡祥焜，吳玉平，賈迪，董鵬，田世民*

（1.中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心，北京 100123；2.中檢科（北京）測試技術有限公司，北京 100176）

長時間過度運動或高強度運動會產生運動性疲勞，導致機體機能和工作效率下降，長期疲勞還會導致內分泌紊亂、免疫力下降，繼而出現器質性疾病，影響健康。疲勞產生的同時還會出現能量物質、激素水平、代謝調節酶類、抗氧化系統酶類、代謝產物等內環境的變化[1]。目前，疲勞產生機制主要包括能量耗竭、代謝產物堆積、離子代謝紊亂、保護性抑制、氧自由基損傷-脂質過氧化學說[2-4]。近些年，國內外學者開展了大量的食源性抗疲勞活性成分的相關研究工作，表明通過補充含有氨基酸類、多糖類、維生素、多酚、生物堿、類胡蘿卜素以及皂苷類等天然活性成分的食源性物質，可有效延緩疲勞的發生和促進體力恢復[5-6]，因此，開發具有抗疲勞功能的保健食品，對于促進人體健康具有積極意義。蘆筍（Asparagus officinalis L.）是天門冬科天門冬屬多年生草本植物石刁柏的幼苗，含有豐富的蘆筍多糖、黃酮類化合物、維生素、蛋白質和甾體皂苷等物質，蘆筍中提取的皂苷、粗多糖、黃酮類等活性成分，具有抗癌抗腫瘤、免疫調節、抗氧化、降血糖、血脂等多方面的藥理作用[7-8]，作為藥食兩用的名貴蔬菜，具有很高的營養保健價值。蘆筍及相關產品在抗疲勞研究方面已有報道[8-12]，由于采用蘆筍產地、植株部位不同，終產物的功效成分組分不同，導致報道中活性成分不確定或不盡統一，因此，需要將功效成分定量與功能評價結合研究。本試驗在測定蘆筍提取物中功效成分和穩定性，參考保健食品的抗疲勞功能評價方法，給予小鼠蘆筍提取物30 d后，在測定小鼠負重游泳時間、肝糖原和肌糖原、血清尿素氮、血乳酸的基礎上，增加了小鼠運動前后血糖指標的檢測，探討蘆筍提取物抗疲勞效果，以期為蘆筍提取物類的保健食品開發和利用提供實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蘆筍提取物黃褐色粉末狀固體（生產批號CS17-DF-009）：秦皇島長勝營養健康科技有限公司。

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級健康雄性ICR小鼠[生產許可證號：SCXK（京）2016-0006]192只，體重18 g～22 g：北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠飼養在SPF級動物房中[使用許可證號：SYXK（京）2018-0007]，食水自由攝入，動物房溫度20℃～26℃，濕度40%～70%，光照為12 h明12 h暗；維持鼠料[生產許可證號：SCXK（京）2015-0015]：斯貝福（北京）生物技術有限公司。

1.1.2 試劑

肝/肌糖原測定試劑盒（蒽酮法）（批號：20180615）：南京建成生物工程研究所；血清尿素氮試劑盒（批號：170831）、RANDOX多項血清復合質控（批號：1225UN）：中生北控生物科技有限公司；乳酸檢測芯片（批號：CL1807）、破膜液（批號：H17368E）、系統液（批號：S17053）、乳酸標準溶液（批號：M18025）：德國 EKF 診斷公司。

1.1.3 儀器與設備

TBA-120FR全自動血生化分析儀：日本東芝（TOSHIBA）公司；BIOSEN C-line 15葡萄糖/乳酸分析儀：德國EKF診斷公司；HH-S數顯恒溫游泳箱：金壇市華龍實驗儀器廠；U-3900紫外分光光度計：日本日立集團；Synergy H1M酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；3K15冷凍離心機：美國Sigma公司；0.8 mm焊錫絲：上海向智電子有限公司；PC2810計時器：深圳天福電子有限公司；10 μL采血管：德國EKF 診斷公司；5 mL、1 mL和200 μL 加樣器：德國 eppendorf公司；10 mL 移液管、尖底15 mL離心管、平底96孔細胞培養板：美國corning公司。

1.2 方法

1.2.1 穩定性試驗

參照保健食品在注冊檢驗時在37℃、75%的恒溫恒濕條件下進行3個月的加速破壞性試驗的方法，將樣品放在溫度為 37℃～40℃，濕度為（75±5）%的恒溫恒濕培養箱中0個月（放置前）、1個月、2個月、3個月進行加速試驗后，檢測總皂苷、粗多糖、總黃酮含量，以考察蘆筍提取物在保質期內有效成分的穩定性。粗多糖按白鴻的苯酚-硫酸分光光度法測定[13]。總皂苷測定：用水飽和正丁醇提取凈化之后，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液 200 μL、高氯酸溶液 800 μL，蓋塞后混勻，70℃水浴15 min，取出后于冰水中冷卻5 min，加入5 mL冰醋酸混勻，移入比色皿中，于535 nm波長下測定吸光度。總黃酮依據保健食品檢驗與評價技術規范（2003版）的第四章總黃酮測定方法[14]。

1.2.2 蘆筍提取物抗疲勞功能研究

1.2.2.1 實驗動物分組、劑量設定、灌胃給樣

小鼠適應3 d后，取健康雄性ICR小鼠，將動物隨機分為4大組（負重游泳、肝/肌糖原、血清尿素氮、血乳酸和血糖測定組），每大組48只，再按體質量隨機分為去離子水陰性對照組和低、中、高3個劑量組[0.5、1.0、1.5 g/（kg·d）蘆筍提取物組]，每組12只。分別稱取0.5、1.0、1.5 g蘆筍提取物，用去離子水定容至20 mL，充分溶解混勻后備用，去離子水對照組用去離子水，均按20 mL/（kg·d），給予灌胃，每日1次，連續給樣30 d，每周根據體重調整灌胃量。

1.2.2.2 指標測定方法

在末次給予樣品30 min后，參考保健食品緩解體力疲勞功能評價方法測定各項生理指標[14]。負重游泳：將尾根部負荷5%體重鉛皮的小鼠置于水溫25℃游泳箱中游泳，小鼠負重游泳時間為小鼠入水至力竭而沉入水中并持續8 s不能浮出水面的時間。肝糖原和肌糖原測定：在正常狀態下，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取肝臟和腓腸肌，生理鹽水清洗，濾紙吸干后，嚴格按照南京建成試劑盒操作說明書測定肝糖原和肌糖原含量。高尿素模型小鼠血清尿素氮（urea nitrogen，UREA）測定：小鼠在溫度為30℃的水中不負重游泳90 min，休息60 min后，小鼠拔眼球采全血約1 mL（不加抗凝劑），置4℃冰箱約60 min，血凝固后3 000 r/min離心15 min，取血清，全自動血生化儀測定尿素氮。血乳酸和血糖測定：小鼠不負重在溫度30℃的水中游泳10 min后停止，分別于游泳前、游泳后0 min和游泳后20 min，眼眶靜脈叢采全血10 μL加入檢測試劑中，混勻后上機測定血乳酸和血糖。

1.2.2.3 統計分析

采用SPSS19.0進行統計分析，統計結果以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為顯著差異，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 蘆筍提取物中3種功效成分穩定性研究

蘆筍提取物中總皂苷、粗多糖、總黃酮的穩定性試驗結果見表1。

表1 蘆筍提取物中總皂苷、粗多糖、總黃酮的穩定性試驗結果Table 1 Stability test results of total saponins，crude polysaccharides and total flavones in asparagus extracts

結果表明，該蘆筍提取物中功效成分含量依次為粗多糖>總皂苷>總黃酮，總黃酮含量極低，為25 mg/100 g。經過3個月的加速破壞性試驗后，總皂苷、粗多糖穩定性良好，總黃酮含量下降比率為20.0%，穩定性稍差。總皂苷、粗多糖、總黃酮的衰減率分別為6.3%、6.9%、20.0%。在研究中，可將總皂苷和粗多糖作為蘆筍提取物的主要標志性成分。

2.2 蘆筍提取物抗疲勞功能研究

2.2.1 小鼠的一般情況觀察

整個實驗中，陰性對照組與3個劑量組的小鼠被毛有光澤、眼有神，未見飲食、精神和行為活動的異常，研究結束時，各組小鼠的末期體重和體重增長值，差異均無統計學意義（P>0.05），說明蘆筍提取物對小鼠無不良影響。

2.2.2 蘆筍提取物對小鼠負重游泳時間的影響

運動耐力的下降是疲勞最直接的表現，負重游泳時間的長短可作為判斷機體疲勞程度的客觀指標[15]。蘆筍提取物對小鼠負重游泳時間的影響見表2。

表2 蘆筍提取物對小鼠負重游泳時間的影響Table 2 Effect of asparagus extracts on the time of weight-loading swimming in mice

小鼠負荷5%體重鉛皮游泳至力竭時間，與陰性對照組比較，1.0、1.5 g/（kg·d）劑量組小鼠負重游泳時間顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），以1.5 g/（kg·d）劑量組效果最佳。

2.2.3 蘆筍提取物對小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響

肌糖原、肝糖原和血糖組成機體的糖儲備，其大小與運動能力呈正相關[16-17]。肝糖原是血糖的貯存庫，需要時可釋放入血，以維持血糖的正常水平，保證生命活動及運動能力，肝糖原貯備對維持長時間運動血糖濃度起重要作用。肌糖原氧化分解為肌肉的舒縮活動提供能量并提高運動時的輸出功率，是運動中獲得好成績的物質基礎，肌糖原降低與運動性疲勞和運動性損傷的發生有密切關系[18]。蘆筍提取物對小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響見表3。

在正常狀態下，3個劑量組小鼠肝糖原含量顯著增加，差異有統計學意義[0.5、1.5 g/（kg·d）劑量組均P＜0.05，1.0 g/（kg·d）劑量組P＜0.01]；1.0、1.5 g/（kg·d）劑量組小鼠肌糖原含量顯著增加，差異有統計學意義[1.0 g/（kg·d）P＜0.01，1.5 g/（kg·d）P＜0.05]，1.0、1.5 g/（kg·d)無劑量效應關系，均以中劑量效果最佳。

表3 蘆筍提取物對小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響Table 3 Effect of asparagus extracts on hepatic and muscular glycogen level in mice

2.2.4 蘆筍提取物對高尿素模型小鼠血清尿素氮水平的影響

血尿素氮是蛋白質的代謝產物，激烈運動時，蛋白質和氨基酸的分解代謝加強，導致尿素氮含量升高，對于評價機體在體力負荷時的承受能力是一個非常靈敏的指標[14]。

蘆筍提取物對小鼠血清尿素氮水平的影響見表4。

表4 蘆筍提取物對小鼠血清尿素氮水平的影響Table 4 Effect of asparagus extracts on serum urea level in mice

不負重游泳90 min建立高尿素模型，休息60 min后，與陰性對照組比較，3個劑量組血清尿素氮含量略有降低，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2.5 蘆筍提取物對運動前后小鼠血乳酸、血糖水平的影響

血乳酸是與疲勞相關的重要的生化指標，長時間大強度運動，由于組織缺血、缺氧，造成組織細胞產生大量乳酸，肌肉中pH值隨著乳酸濃度上升而下降，使磷酸果糖激酶的活性受抑制，機體能量代謝水平降低，致使運動能力下降[19]，隨著乳酸的積累也開始了乳酸的自然清除，乳酸積累的程度取決于乳酸產生和清除的速度，乳酸是否能及時消除就十分重要[20]。蘆筍提取物對小鼠血乳酸水平及血乳酸曲線下面積的影響見表5。

在游泳前、游泳后0 min、游泳后20 min分別檢測血乳酸含量，與陰性對照組比較，僅1.5 g/（kg·d）劑量組在游泳后0 min血乳酸值顯著降低（P＜0.05）；3個劑量組的血乳酸曲線下面積均降低，但僅1.5 g/（kg·d）劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。

表5 蘆筍提取物對小鼠血乳酸水平及血乳酸曲線下面積的影響Table 5 Effect of asparagus extracts on blood lactic acid and area under curve of the blood lactic acid in mice

隨著運動強度、運動時間的增加，血糖耗竭，這時肌糖原、肝糖原分解，補充葡萄糖，體內各組織細胞活動所需的能量大部分來自葡萄糖，所以血糖必須保持一定的水平才能維持體內各器官和組織的需要[21]。蘆筍提取物對運動前、后小鼠血糖水平的影響見表6。

表6 蘆筍提取物對運動前、后小鼠血糖水平的影響Table 6 Effect of asparagus extracts on blood glucose in mice

本研究結果表明，與陰性對照組比較，各劑量游泳前、游泳后0min血糖值，差異無統計學意義（P＞0.05）；1.0、1.5 g/（kg·d)劑量組小鼠在游泳后20 min血糖值升高，差異有統計學意義（P＜0.05），3個劑量組血糖下降值均減少，差異有統計學意義[0.5、1.5 g/（kg·d）劑量組P＜0.05，1.0 g/（kg·d）劑量組P＜0.01]。提示該受試物有促進組織對糖原的利用，加快血糖水平恢復的作用。

3 結論

近些年來，國內外學者開展了許多食源性抗疲勞活性成分的相關研究，為新型抗疲勞產品研究與開發提供參考[6，22]，本研究可補充抗疲勞的食源性活性成分目錄。本試驗蘆筍提取物的主要活性成分為總皂苷和粗多糖，其中總皂苷含量為0.79 g/100 g，3個月恒溫恒濕加速試驗衰減率為6.3%，粗多糖為2.9×104mg/100 g，3個月恒溫恒濕加速試驗衰減率為6.9%，表明總皂苷和粗多糖穩定性良好，可用于保健食品中蘆筍提取物的質量控制。

能量物質的消耗、代謝產物的堆積是產生疲勞的重要原因，采用引起疲勞的某些生化變化為指標，觀察疲勞的出現及發展的過程，是研究運動性疲勞最有效的方法[2，23]，而要評價受試物是否有抗疲勞的作用，采用與疲勞產生機制有關的生物化學指標才能得到可靠的結果[24]，糖原、血清尿素氮及血乳酸含量的變化最具有代表性，通常也作為檢測疲勞的生化指標[25-28]，而血糖與各組織糖代謝關系密切，是中樞神經系統的唯一能源，血糖水平除了反映糖代謝水平外，還可反映中樞神經系統的疲勞狀況，已被運動醫學家用于評價運動員的訓練水平，近些年來也被用在保健食品抗疲勞的研究工作中[29]。研究結果表明，補充蘆筍提取物能促進小鼠肝糖原和肌糖原能源物質的積累，延緩疲勞的發生，降低血乳酸曲線下面積，與文獻報道一致[9-10，12]。蘆筍提取物能夠增加肌糖原和肝糖原儲備，在運動中維持較高血糖水平，延長運動時間，推測其機制是通過增加肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，清除運動產生自由基[12]，增加乳酸脫氫酶活力，從而降低體內血乳酸水平，延緩疲勞的發生并加速其消除[9，30]；未發現蘆筍提取物對血清尿素氮有影響，與田穎剛等的報道一致[12]。當糖原被大量消耗時，機體活動能力降低，從而導致全身性疲勞的發生，糖原貯備的提高有利于機體耐力速度的提高，并減少蛋白質和含氮化合物的分解代謝，本研究結果也印證了這點。本次研究中還發現蘆筍提取物可以提高游泳后小鼠血糖水平，減少血糖下降值，在運動中能夠維持較高的血糖水平，從而延緩疲勞發生，而此種血糖測定的實驗方法可用于抗疲勞功能研究。綜上所述，0.5 g/（kg·d） ～1.5 g/（kg·d）蘆筍提取物對于小鼠有抗疲勞效果，以1.5 g/（kg·d）劑量抗疲勞效果最好，也證實了可通過多種途徑緩解體力疲勞，對小鼠的一般健康情況和體質量并無影響，是理想的營養補充劑。因此，有針對性地補充蘆筍提取物來減緩體力疲勞的發生是解決運動性疲勞的有效途徑之一，但應用到人群試食的功效仍需進一步研究。