河北省大豆主要病原真菌鑒定及防治藥劑篩選

畢秋艷, 黨志紅, 朱偉旗, 高占林?, 韓秀英?, 趙建江, 王文橋, 路粉, 吳杰

1河北省農林科學院植物保護研究所/河北省農業有害生物綜合防治工程技術研究中心/農業農村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000；2石家莊市農林科學院趙縣實驗基地，石家莊 051530

0 引言

【研究意義】大豆是全世界最重要的農作物之一，在農業生產和社會發展中發揮著重要作用。根據國家統計局數據顯示，2019年中國大豆播種面積933萬公頃（1.4億畝）。據農情調查，2019年河北省大豆種植面積10.4萬公頃。河北省處于黃淮海夏大豆產區和北方春大豆產區交界地帶[1]，四季分明，光照充足，適宜大豆生產[2]。張家口、承德、唐山和秦皇島等地區為春大豆的主要產區[3]。其他地區以夏大豆為主，占整個河北省大豆種植面積的80%左右。隨著大豆種植面積的擴大，病害成為影響其產量的主要因素之一。目前，我國已報道的大豆病害約40余種[4]，病原主要包括真菌、細菌、線蟲和病毒等，其中70%—80%為真菌病害，一般會造成10%—30%減產，嚴重時可達50%以上，更嚴重時甚至會導致絕產[5]。大豆真菌病害不僅直接造成產量與品質降低，部分病原真菌在侵染過程中還分泌多種對人畜有害的毒素與代謝物，對農產品的安全性構成極大威脅[6]。河北省作為全國的大豆主產區，及時科學診斷新病害并提出具體的防治藥劑，對于提高大豆產量和品質具有十分重要的現實意義[7]。【前人研究進展】大豆真菌病害種類多、分布廣、危害大，各種病害從癥狀上難以區分，導致防治困難。常見的大豆病害包括大豆根腐病、菌核病、灰斑病、褐紋病、黑斑病、銹病、白粉病等[4]。隨著大豆種植面積的擴大，自20世紀90年代，病害逐漸被認為是大豆生產的限制因子[8]。大豆病害在不同地區的病原菌種類復雜，有些種的病原菌只在國外或中國真菌志上報道。大豆上同一種病害在不同國家、不同區域可能為同一屬不同種病原菌所致。炭疽菌屬（Colletotrichum）是一類重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范圍均較為廣泛。該菌變異較多，種內存在不同的生理小種[9]。對巴西進境大豆進行病害分離，參考Ainsworth分類系統鑒定出4種炭疽菌，證實了大豆炭疽菌具有多樣性。大豆灰斑病菌也具有非常明顯的生理分化現象[10]。阿根廷大豆曾被鑒定出主要病原菌分別為核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、大雄疫霉大豆專化型（Phytophthora megasperma）、大豆猝死綜合癥病菌（Fusarium tucumaniae）、叉絲殼菌（Microsphaera diffusa）。巴西大豆曾被鑒定出主要病原菌有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）、平頭炭疽菌（Colletotrichum truncatum）和黑線炭疽菌（Colletotrichum dematium）[9]。從俄羅斯種植區采集的大豆植株的葉片和莖桿樣品中共分離到6種病原菌，分別為鏈格孢（Alternariasp.）、大豆北方莖潰瘍病菌（Diaporthe phaseolorumvar.caulivora）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）、鐮孢菌（Fusariumsp.）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、毛霉（Mucor fragilis）[11]。對美國進境大豆鑒定出主要病原菌包括細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、櫻桃鏈格孢（Alternaria cerasi）、苘麻鏈格孢（Alternaria abutilonis）、百日菊鏈格孢（Alternaria zinniae）、落葵鏈格孢（Alternaria basellae）[12]。阿根廷、巴西、俄羅斯和美國鑒定出的大豆主要病原菌可以在辣椒、雜草、小麥等植物上存在共生現象。在大豆病害化學防治方面，根腐病一般采用 50%多菌靈可濕性粉劑+50%福美雙可濕性粉劑（3﹕2），用藥總量為種子重的0.5%進行拌種防治[7]。由于藥劑拌種只能控制前期根部病害，成株期一旦發病應盡早噴廣譜性殺菌劑防治。大豆灰斑病菌群體結構發生變化，導致某些主栽品種在多雨年份時會大量發生灰斑病[10]。在灰斑病發病初期，應及時噴灑1—2次殺菌劑減輕發病。70%甲基硫菌靈可濕性粉劑1 000倍液或 75%百菌清可濕性粉劑 700—800倍液對灰斑病具有抑制作用[13]。在大豆疫病發病初期，60%氟嗎啉·代森錳鋅可濕性粉劑1 500倍或50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1 500倍噴霧對其具有抑制作用[14]。腐霉利、菌核凈、三唑酮和苯醚甲環唑等對大豆白粉病和菌核病均有很好的防治效果[15]。大豆銹病的防治藥劑有三唑酮、萎銹靈、多菌靈和代森錳鋅等[16]。此外，大豆炭疽病防治藥劑以苯醚甲環唑或百菌清為主；大豆紫斑病、黑斑病、灰星病、莖枯病防治藥劑均以多菌靈或代森錳鋅為主[15]。綜上，大豆病害的防治使用比較頻繁的殺菌劑以多菌靈、甲基硫菌靈、福美雙、菌核凈、腐霉利、三唑酮、萎銹靈、百菌清、退菌特、烯酰嗎啉和代森錳鋅老品種為主，偶見苯醚甲環唑、氟嗎啉·代森錳鋅藥劑的使用。【本研究切入點】近年河北省大豆新增幾種不常見病害[6,15]，由于對其病害及病原菌種類不十分了解[17]，導致藥劑種類的選用比較困難。【擬解決的關鍵問題】對河北省主要大豆真菌病害和病原菌種類進行系統鑒定，并針對所鑒定病害和病原菌展開不同種類殺菌劑的篩選，為河北省大豆真菌病害的有效防治提供依據。

1 材料與方法

試驗于 2019年在河北省農林科學院植物保護研究所完成。

1.1 病樣的采集與病原菌分離、保存

筆者課題組于2019年5—9月自河北省大豆主產區采集具有不同典型、明顯病癥的地上部大豆葉片、夾和莖稈，帶回實驗室，用清水將其沖洗并晾干，在病健交界處剪取長5 mm、寬2—3 mm的長方形標本組織，用0.1%升汞溶液消毒5 min，再用無菌水漂洗3次，直接移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基平板上。每個培養皿中接種3—5塊標本組織，置于溫度25℃、相對濕度70%、黑暗培養箱內恒溫培養，待菌落長出后選取每種病原菌形態一致的菌落進行反復純化，挑取邊緣菌絲再接于PDA平板上，于相同條件下培養7—10 d，待產孢后挑取單孢進行培養3—7 d，獲得純培養菌株。單孢菌株接種到常規PDA培養斜面上，4℃保存備用。

1.2 主要試劑、儀器、殺菌劑及培養基

Fungal DNA Kit D3390試劑盒，Omega Bio-Tek公司；PCR擴增試劑盒、2×Taq PCR Mix、DNA Marker DL2000，日本TaKaRa公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑均為國產分析純。LRH-250F型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；正置BX63顯微鏡，日本Olympus公司；超景深三維VHX-1000立體顯微鏡，KEYENCE基恩士（中國）有限公司；Thermo NanoDrop 2000紫外分光光度計，美國NanoDrop科技有限責任公司；SimpliAmpTMThermal Cycler PCR儀，美國Life technologies公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

殺菌劑：95%苯醚甲環唑原藥（利爾化學股份有限公司）；99.5%氟菌唑原藥（江蘇禾本生化有限公司）；95%葉菌唑原藥（江蘇輝豐生物農業股份有限公司）；98%肟菌酯原藥（山東省聯合農藥工業有限公司）；95%嘧菌酯原藥（江蘇輝豐生物農業股份有限公司）；97.5%吡唑醚菌酯原藥（浙江禾本科技有限公司）；95%氰烯菌酯原藥（江蘇省農藥研究所股份有限公司）；96%氟吡菌酰胺原藥（拜耳股份公司）；96%啶酰菌胺原藥（安徽廣信農化股份有限公司）；99.4%辛菌胺原藥（陜西省西安嘉科農化有限公司）；95%乙蒜素原藥（南陽神圣農化科技有限公司）。制劑：10%苯醚甲環唑水分散粒劑（瑞士先正達作物保護有限公司）；30%氟菌唑可濕性粉劑（日本曹達株式會社）；60 g·L-1葉菌唑水乳劑（江蘇輝豐生物農業股份有限公司）；50%肟菌酯懸浮劑（青島奧迪斯生物科技有限）；250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑（先正達南通作物保護有限公司）；250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油（巴斯夫歐洲公司）；25%氰烯菌酯懸浮劑（江蘇省農藥研究所股份有限公司）；41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑（拜耳股份公司）；50%啶酰菌胺水分散粒劑（巴斯夫歐洲公司）；1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑（陜西省蒲城美爾果農化有限公司）；80%乙蒜素乳油（南陽神圣農化科技有限公司）。

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至 1 L；不加瓊脂為馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）液體培養基。AEA培養基：酵母浸粉10 g、NaNO36g、KH2PO41.5 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、丙三醇20 mL、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L；YBA培養基：酵母浸粉10 g、蛋白胨5 g、醋酸鈉20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 河北省大豆主要真菌病害病癥及病原菌分離純化 觀察不同植株病害病癥（A—E），記錄病斑顏色、發病程度、發病規律等，將典型病癥照相并帶回實驗室對病原菌進行分離培養。

1.3.2 病原菌的形態學鑒定及回接致病性驗證 菌落特征觀察：將純化后的病原菌菌株分別接種于PDA平板上，置于25℃、黑暗培養箱內恒溫培養5 d，進行菌落特征的觀察和拍照，記錄菌落形態、顏色。

菌絲、孢子形態觀察：對純化菌株平板培養 5 d后在超景深三維VHX-1000立體顯微鏡下觀察菌絲形態、顏色，之后繼續平板培養至10—15 d后產孢；對平板上不能產孢的病原菌A，將其于PDA平板上培養5 d后在菌株邊緣打孔，取其直徑5 mm菌柄至30 mL PD培養液進行搖床160 r/min振動培養7 d至產孢；正置BX63顯微鏡下觀察孢子的形態、顏色及結構特征等，并進行顯微形態觀測、拍照，參照有關資料進行鑒定。

經預試驗后，對于不能很好使葉片致病的 A、B病原菌，在PDA培養基上25℃培養5 d后，用滅菌牙簽蘸取打孔直徑菌落2 mm，與豆莖稈成45°針刺植株第一莖節，刺穿后旋轉牙簽，并緩慢抽出[18]。其他病原菌回接致病性驗證，選取室內無菌培養的健康大豆葉片噴霧接種病原菌孢子懸浮液，每片葉子噴濃度為1×103個/mL的孢子懸浮液0.5 mL。待接種發病后，觀察致病力，并從病部再分離病原菌，比較所分離病原菌與原接種病原菌是否一致。

1.3.3 病原菌的分子生物學鑒定 病原菌菌株在PDA培養基25℃黑暗培養7 d后，用滅菌手術刀刮取培養基表面菌絲 50—200 mg置于離心管中，采用Fungal DNA Kit D3390試劑盒抽提病原菌基因組DNA，于超微量紫外分光光度計測定DNA濃度及純度，其余的DNA溶液置于-20℃冰箱保存備用。真菌物種鑒定使用 rDNA-ITS 作為 Marker片段，使用ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC通用引物擴增。PCR擴增反應體系：10×Ex Taq buffer 2.0 μL，5 U Ex Taq 0.2 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mix 1.6 μL，引物 ITS1 1 μL，引物 ITS4 1 μL，DNA 0.5 μL，ddH2O 13.7 μL，總體積20 μL。PCR擴增反應程序條件：95℃預變性5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，25 個循環，72℃ 10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V電壓電泳30 min PCR擴增結果，觀察圖像是否有特異性目的片段。將含有目的條帶的PCR產物交由生工生物工程（上海）股份有限公司。用各基因相對應的PCR擴增引物進行3730XL一代雙末端測序，對測序結果質控與組裝、拼接。將所得序列校對后于 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）核酸序列數據庫進行BLAST同源性比對，然后用MEGA 7.0軟件根據各菌株 rDNA-ITS基因序列進行系統發育分析，用 NJ法（neighbor-joining method）構建分子進化樹，并進行1 000次自展抽值檢驗分子進化樹可靠性。分析病原菌菌株與數據庫菌株的親緣關系，進行近源物種信息的確認。同時，將1.3.2室內接種的致病力菌株分離鑒定，rDNA-ITS序列檢測其與原接種病原菌序列是否一致。根據1.3.1、1.3.2和1.3.3初步分析的病原菌種類結果，對已有特異性引物的病原菌進行特異性保守序列分子驗證鑒定。使用特異性引物TEF1-αF：ATGGGTAAGG ARGACAAGAC 和 TEF1-αR：GGARGTACCAGTSAT CATGTT對病原菌A[19]、ACT-512F：ATGTGCAAGGC CGGTTTCGC和ACT-783R：TACGAGTCCTTCTGGC CCAT對病原菌B[20]、EF-1F：CATCGAGAAGTTCG AGAAGG和EF-1R：TACTTGAAGGAACCCTTACC對病原菌D[21]進行特異性擴增。PCR擴增反應體系、反應程序條件、電泳、測序、分子進化樹的構建和分析同上。

1.4 河北省大豆主要真菌病害防治藥劑篩選

1.4.1 室內殺菌劑的毒力測定 采用菌絲生長速率法測定5種不同種類殺菌劑的11個代表品種對河北省大豆主要病原菌的抑制作用。

供試原藥分別用適量丙酮溶解，配制成質量濃度為1 000 μg·mL-1的母液，加入無菌水進行系列稀釋，通過預試驗得到供試藥劑對不同病原菌的有效濃度范圍。苯醚甲環唑和氟菌唑為 3、1.5、0.75、0.375、0.1875、0.0938、0.0469、0.0234 μg·mL-1；葉菌唑為 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.1563、0.0078 μg·mL-1；肟菌酯和嘧菌酯為 200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7813 μg·mL-1；吡唑醚菌酯為 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563 μg·mL-1；氰烯菌酯和氟吡菌酰胺為200、50、12.5、3.125、0.7813、0.1953、0.0488、0.0122、0.0061 μg·mL-1；啶酰菌胺為800、200、50、12.5、3.125、0.7813、0.1953 μg·mL-1；辛菌胺為 80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg·mL-1；乙蒜素為 600、300、150、75、37.5、18.75、9.375、4.6875 μg·mL-1。酰胺類殺菌劑（氟吡菌酰胺、啶酰菌胺）用YBA含藥平板[22]，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（肟菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、氰烯菌酯）用 AEA+水楊肟酸（100 μg·mL-1）含藥平板[23]，其他藥劑用 PDA 含藥平板，同時設置丙酮和空白對照。將分離鑒定好的木賊鐮孢（Fusarium equiseti）、大豆炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti）、莖點霉菌（Phoma herbarum）、鏈格孢（Alternaria alternata）、嘴突凸臍蠕孢（Exserohilum rostratum）分別接種于PDA平板上，用直徑5 mm打孔器在預培養5 d的各大豆病原菌菌落邊緣打取菌餅，正面朝下分別接種到各含藥和空白對照平板上。每處理重復4次，置于25℃、相對濕度70%、黑暗培養箱內恒溫培養。培養5 d后，對照組病原真菌菌落接近長滿平板，采用十字交叉法分別測量各處理的菌落直徑。計算各處理濃度的抑制率[22-23]，抑制率（%）＝100×（對照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑）／對照菌落增長直徑。

1.4.2 殺菌劑在離體葉片或幼莖上對大豆主要病害的防治效果 不同種類殺菌劑代表品種按照其使用說明的推薦劑量分別設置處理濃度：30 μg·mL-1苯醚甲環唑、75 μg·mL-1氟菌唑、6 μg·mL-1葉菌唑、150 μg·mL-1肟菌酯、150 μg·mL-1吡唑醚菌酯、50 μg·mL-1嘧菌酯、60 μg·mL-1氰烯菌酯、50 μg·mL-1氟吡菌酰胺、500 μg·mL-1啶酰菌胺、12 μg·mL-1辛菌胺、100 μg·mL-1乙蒜素。預試驗后對于不能很好使葉片致病A、B病原菌，選擇大豆健康幼苗采取針刺莖節接種病原菌的方法。大豆第一片真葉平展后針刺第一莖節接種。將病原菌在PDA 培養基上25℃培養5 d后，用滅菌牙簽蘸取打孔直徑菌落2 mm，與豆莖稈成 45°針刺植株第一莖節[18]，刺穿后旋轉牙簽，并緩慢抽出，以未蘸取菌落的滅菌牙簽針刺植株作為對照。接種后植株置于25℃、相對濕度95%—100%培養室保濕48 h，再用壓力0.1 MPa的空壓機帶動喉頭噴霧器將不同濃度殺菌劑均勻噴施到供試植株上，每株噴施1 mL藥液。所有殺菌劑處理各重復5次，空白對照噴蒸餾水，試驗重復4次。之后 25℃，相對濕度 75%—100%繼續培養，7 d后調查發病情況并計算各殺菌劑對病害的防治效果。

殺菌劑在離體葉片上對其他大豆主要病害的影響：選擇健康的大豆葉片，每兩片葉子背面朝上置于直徑15 cm培養皿中的濾紙上，每皿加15 mL蒸餾水保濕，用濕潤的脫脂棉包裹葉柄。將病原菌培養至產孢，每皿葉子噴濃度為1×103個/mL的孢子懸浮液0.5 mL；于25℃下恒溫培養1 d后，用壓力0.1 MPa的空壓機帶動喉頭噴霧器將不同濃度殺菌劑均勻噴施到供試葉片上，以霧滴均勻欲滴而不落為度，每皿葉子1 mL藥液。所有殺菌劑處理各重復5皿，空白對照噴蒸餾水，試驗重復4次，所有處理于25℃恒溫光照培養，7 d后調查發病情況并計算各殺菌劑對病害的防治效果。

（4）使用種次號能實現計算機編目。編目系統可自動查重而生成新的種次號，實現種次號的自動取號，提高編目效率。

病害分級調查參照大豆根部病害和葉部病害分級標準改進進行[24]。0級：無病斑；1級：病斑面積占植株/葉片總面積1/4以下；2級：病斑面積占植株/葉片總面積1/4—1/2；3級：病斑面積占植株/葉片總面積1/2以上；4級：病斑連片，但沒有壞死；5級：植株/葉片萎蔫或枯死。計算公式：病情指數=Σ（各級病株/葉數×相對級數值）/（調查總株/葉數×5）×100；防治效果（%）=100×（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數。

1.5 數據分析

應用Excel和SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析，采用 Duncan氏新復極差法進行不同殺菌劑對同種病害防治效果的差異顯著性分析。

2 結果

2.1 大豆主要真菌病害癥狀

病害A：初期莖基部表皮出現淡紅褐色不規則病斑，病斑逐漸變成灰褐色凹陷壞死，并繞根莖擴展，地上部植株矮小瘦弱，葉色淡綠，后期分枝、結莢干枯，形成灰黑色壞死斑（圖1-A-1），癥狀似土傳病害。

病害B：大豆莢部病斑為圓形，褐至淺灰色（圖1-B-1），嚴重時小黑點呈輪紋狀排列，病莢無種子或皺縮、干癟，癥狀似炭疽病。

病害C：發病初期葉片出現黃褐色稍凹陷斑點，病斑逐漸擴大，凹陷加深，邊緣變褐色，病斑邊界清晰（圖 1-C-1），后期多個病斑融合成不規則大斑，癥狀似葉斑病的一種。

病害D：葉片發病初期圓形至不規則形病斑，中央褐色，四周略隆起，有時呈暗褐色輪紋狀，后期病斑擴展或破裂，葉片卷曲干枯（圖 1-D-1），濕度大時表面有密集黑色霉層，癥狀也似葉斑病的一種。

2.2 大豆主要病原菌形態學及回接致病性驗證

病原菌A：在PDA培養基上，菌落形狀圓形，米白色至淡黃色，氣生菌絲較短，棉絮狀，不能長至培養皿蓋（圖1-A-3、1-A-4）。孢子形態：大型分生孢子似月牙形，3—6個分隔，分隔明顯，頂孢呈錐形（圖1-A-5）。通過形態特征觀察該菌被初步鑒定為鐮孢菌的一種。病原菌回接驗證結果表明，該病原菌具有致病力（圖 1-A-2）。室內回接病原菌致病組織進行再分離，獲得的病原菌形態特征與原接種菌株一致。

病原菌B：在PDA培養基上，菌落圓形，氣生菌絲氈狀或絨狀，緊貼培養基生長，菌落邊緣整齊，呈灰白色，培養3 d后菌絲開始變黑（圖1-B-3、1-B-4）。培養3 d后開始產生厚垣孢子，厚垣孢子單生或串生于菌絲頂端或中間，褐色至黑褐色，光滑。分生孢子單胞，無色，新月形或鐮刀狀，一端尖銳，另一端較鈍，無附著胞產生（圖 1-B-5）。通過形態特征觀察該菌被初步鑒定為大豆炭疽菌的一種。病原菌回接驗證結果表明，該病原菌具有致病力（圖 1-B-2）。室內回接病原菌致病組織進行再分離，獲得的病原菌形態特征與原接種菌株一致。

病原菌C：在PDA培養基上，菌落形態呈近圓形，有輪紋，邊緣不均勻，菌落中央稍隆起，菌絲灰白色，生長旺盛，棉絮狀（圖 1-C-3、1-C-4）。分生孢子器呈橢圓形至圓形，黑褐色；分生孢子呈卵圓形或橢圓形，無色單胞（圖1-C-5）。觀察其形態特征與莖點霉描述相符。病原菌回接驗證結果表明，該病原菌具有致病力（圖1-C-2）。室內回接病原菌致病組織進行再分離，獲得的病原菌形態特征與原接種菌株一致。

病原菌D：在PDA培養基上，菌落簇生，褐色或青褐色（圖1-D-3、1-D-4）。分生孢子梗單生或數根束生，暗褐色；分生孢子倒棒形（圖 1-D-5），3—6個串生，有縱隔膜1—2個，橫隔3—4個，橫隔處偶有縊縮現象。通過形態特征觀察該菌被初步鑒定為鏈格孢的一種。病原菌回接驗證結果表明，該病原菌具有致病力（圖 1-D-2）。室內回接病原菌致病組織進行再分離，獲得的病原菌形態特征與原接種菌株一致。

病原菌E：在PDA培養基上，菌落灰褐色，中央隆起，棉絮狀，邊緣氣生菌絲絨毛狀，背面褐色（圖1-E-3、1-E-4）。分生孢子梗單生或簇生于菌絲，褐色，光滑，多隔膜。分生孢子淡褐色至中等褐色，橢圓形或近圓柱形，端部鈍圓，基部有明顯突出的臍點，常在兩端有隔膜增厚現象，中等褐色，兩端細胞顏色稍淺（圖1-E-5）。通過形態特征觀察該菌被初步鑒定為凸臍蠕孢的一種。病原菌回接驗證結果表明，該病原菌具有致病力（圖1-E-2）。室內回接病原菌致病組織進行再分離，獲得的病原菌形態特征與原接種病原菌一致。

2.3 河北省大豆主要病原菌分子生物學鑒定及對應病害種類確定

以ITS1和ITS4為引物，對田間分離出的5種病原菌進行PCR擴增，結果均能擴增出約600 bp的單一條帶，大小在500—750 bp（圖2-a）。用GenBank核酸序列數據庫和MEGA 7.0軟件的NJ法根據各菌株擴增出的ITS分子序列進行多重序列比較，構建分子系統發育樹（圖 3—圖 7）。根據 LANDEWEERT等對真菌的分子分類鑒定原則[25]，即通過分子序列比對，序列相似性≥99%鑒定為相同種；序列相似性＞95%且＜99%，鑒定為相同屬；序列相似性≤95%，鑒定為相同科。病原菌A與木賊鐮孢LT617634.1相似性為100%，同時2.2分析該病原菌為鐮孢菌的一種，初步確定引起病害A的病原菌為木賊鐮孢；病原菌B與大豆炭疽菌MH290362.1相似性為100%，同時2.2分析該病原菌為大豆炭疽菌的一種，初步確定引起病害B的病原菌為大豆炭疽菌；病原菌C與莖點霉菌KJ767079.1相似性為100%，同時2.2分析該病原菌為莖點霉菌的一種，初步確定引起病害C的病原菌為莖點霉菌；病原菌 D與鏈格孢 KY951909.1相似性為100%，同時2.2分析該病原菌為鏈格孢的一種，初步確定引起病害D的病原菌為鏈格孢；病原菌E與嘴突凸臍蠕孢GQ169762.1相似性為100%，同時2.2分析該病原菌為凸臍蠕孢的一種，初步確定引起病害E的病原菌為嘴突凸臍蠕孢。利用真菌通用引物ITS1和ITS4對分離的5種室內回接致病菌基因組DNA進行擴增，鑒定結果與原病原菌一致（圖2-b）。

同時，以特異性引物TEF1-αF和TEF-1αR對病原菌A、ACT-512F和ACT-783R對病原菌B、EF-1F和EF-1R對病原菌D進行特異性PCR擴增驗證，結果也均能擴增出約600 bp的單一條帶，大小在 500—750 bp（圖2-c）。用GenBank核酸序列數據庫和MEGA 7.0軟件的NJ法根據各菌株擴增出的TEF1-α、ACT、EF-1α分子序列進行多重序列比較，構建分子系統發育樹（圖8—圖10），病原菌A 與木賊鐮孢LT617634.1、病原菌B與大豆炭疽菌MH290362.1、病原菌D與鏈格孢KY951909.1仍分別聚類在一起。分子序列驗證結果表明，病原菌A、B、D分別為木賊鐮孢、大豆炭疽菌、鏈格孢。

結合病害病癥、病原菌菌落形態、菌絲及孢子顯微形態和基于 ITS、TEF1-α序列系統發育分析，明確病害 A是由木賊鐮孢引起的大豆根腐病，病害 B是由大豆炭疽菌引起的炭疽病，D是由鏈格孢引起的大豆黑斑病。初步明確病害 C是由莖點霉菌引起的莖點霉葉斑病，病害E是由嘴突凸臍蠕孢引起的凸臍蠕孢葉斑病。

2.4 不同種類殺菌劑對5種病原菌的毒力

5種病原菌對三唑類殺菌劑敏感，苯醚甲環唑EC50值 0.0466—1.1102 μg·mL-1，氟菌唑 EC50值 0.0955—1.5024 μg·mL-1，葉菌唑 EC50值 0.0112—0.4206 μg·mL-1。5種病原菌對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑吡唑醚菌酯敏感，EC50值分別為 2.8012、0.1775、0.5791、9.3865 和 2.0022 μg·mL-1；僅木賊鐮孢對肟菌酯敏感，EC50值 1.8804 μg·mL-1；木賊鐮孢和大豆炭疽菌對氰烯菌酯敏感，EC50值分別為 0.0109和4.4280 μg·mL-1。大豆炭疽菌、莖點霉菌、鏈格孢、嘴突凸臍蠕孢對酰胺類氟吡菌酰胺敏感，EC50值2.5741—7.2185 μg·mL-1；大豆炭疽菌、莖點霉菌、嘴突凸臍蠕孢對啶酰菌胺敏感，EC50值 0.4857—2.5139 μg·mL-1。大豆炭疽菌和嘴突凸臍蠕孢對烷基多胺類殺菌劑辛菌胺敏感，EC50值分別為 8.4571 和 7.7361 μg·mL-1。大豆炭疽菌對有機硫仿生殺菌劑乙蒜素敏感，EC50值8.1840 μg·mL-1（表 1）。

表1 不同種類殺菌劑對分離自大豆的5種病原菌的毒力Table 1 Toxicity of different kinds of fungicide against 5 pathogens isolated from soybean

2.5 殺菌劑在離體葉片或幼莖上對大豆主要病害的防治效果

三唑類殺菌劑苯醚甲環唑、氟菌唑、葉菌唑和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑肟菌酯、吡唑醚菌酯對 5種病害防治效果顯著，酰胺類殺菌劑氟吡菌酰胺對除大豆根腐病之外的其他4種病害防治效果顯著，酰胺類殺菌劑啶酰菌胺對莖點霉葉斑病防治效果顯著，烷基多胺類殺菌劑辛菌胺、有機硫仿生殺菌劑乙蒜素對炭疽病和凸臍蠕孢葉斑病防治效果顯著，其防治效果分別達到90%以上；其他殺菌劑對5種病害表現不同程度的防治作用，防治效果為55.41%—89.36%（表 2）。結合 2.4不同種類殺菌劑對 5種病原菌的毒力測定結果，三唑類殺菌劑苯醚甲環唑、氟菌唑、葉菌唑和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑吡唑醚菌酯推薦作為河北省大豆主要真菌病害的優選兼治藥劑。

表2 不同種類殺菌劑在離體葉片或幼莖上對5種大豆真菌病害的防治效果Table 2 Control effects of different kinds of fungicide in vitro or young stems to 5 soybean fungal diseases

3 討論

不同病原菌侵染植物后其病癥存在不同程度的相似性，給病害診斷及病原菌鑒定帶來較大困難。本研究通過病原菌的宏觀形態、菌絲和孢子顯微結構、ITS及特異性分子序列綜合分析，確定河北省大豆主產區的病原菌分別為木賊鐮孢、大豆炭疽菌、莖點霉菌、鏈格孢、嘴突凸臍蠕孢，對應病害分別為大豆根腐病、炭疽病、莖點霉葉斑病、大豆黑斑病、凸臍蠕孢葉斑病。根部病害是危害豆類的重要病害之一，發生普遍，鐮孢菌是引起我國大豆根腐病的主要病原菌。鐮孢菌分多種，種群復雜，近年來常發生不同種鐮孢菌引起的大豆根腐病[26]，本研究發現引起河北省大豆根腐病的病原菌為木賊鐮孢。大豆炭疽病是世界各大豆產區重要病害之一，在烏拉圭大豆上曾發現類似炭疽病癥狀的豆稈，確認其病原菌為大豆炭疽菌[27]。本研究中導致河北省大豆炭疽病的病原菌同樣為大豆炭疽菌。據中國真菌志記載莖點霉菌在雜草上曾有發生[28]，本研究在河北省大豆葉片上發現莖點霉菌。鏈格孢是一類適應性強、極為常見的真菌。全世界已描述的近500個鏈格孢種級分類單位中，95%以上兼性寄生在植物上，引起多種經濟植物病害，如黑斑病、褐斑病、莖枯病、赤星病等。目前國內外關于大豆中鏈格孢的研究較少。據報道，美國大豆分離出的鏈格孢屬于5個不同的種，同時也證實了大豆中鏈格孢菌的多樣性[12]，本研究鑒定出鏈格孢是引發河北省大豆黑斑病的病原菌。嘴突凸臍蠕孢在國外報道其廣泛寄生，寄主主要有稗屬、稻屬、小麥屬、各種雜草等[29]，據中國真菌志記載該病原菌也可侵染大豆，本研究發現凸臍蠕孢葉斑病由該病原菌引發。

河北省大豆真菌病害種類復雜，防治藥劑種類的科學選用成為有效防治大豆真菌病害的關鍵技術之一。生產上往往由于不了解病原菌種類和殺菌劑特性，盲目用藥，造成防治效果降低，同時影響環境[15]。因此，應合理開展大豆病害科學、高效對靶藥劑防治。根據本研究中 5種殺菌劑 11個代表品種對河北省 5種大豆主要病原菌的抑制作用及對相應病害的防治效果，推薦三唑類殺菌劑苯醚甲環唑、氟菌唑、葉菌唑和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑吡唑醚菌酯作為河北省大豆主要真菌病害的優選兼治藥劑。其田間防治效果有待于進一步驗證。

所選用殺菌劑的種類、作用機制與病原菌種類存在一定對應關系。三唑類殺菌劑，其作用機理為影響甾醇類生物合成，使菌體細胞膜功能受到破壞[30]，對子囊菌亞門、擔子菌亞門和半知菌亞門的病原菌均有活性。本研究中木賊鐮孢和大豆炭疽菌無性時期屬于半知菌亞門，有性時期為子囊菌亞門；莖點霉菌屬于半知菌亞門；鏈格孢屬于子囊菌亞門；嘴突凸臍蠕孢屬于半知菌亞門。以上對應關系也可以看出，三唑類甾醇抑制劑苯醚甲環唑、氟菌唑、葉菌唑可以作為河北省大豆主要真菌病害兼治的首選殺菌劑種類之一。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑通過抑制植物病原真菌中細胞色素bc1間的電子傳遞，從而抑制線粒體的呼吸作用，能有效防治子囊菌、擔子菌、半知菌和卵菌等引起的病害，其不同代表品種防治對象及抑制作用存在差異[31]。氰烯菌酯對半知菌亞門、子囊菌亞門的鐮孢菌屬真菌病害有顯著的防治效果。肟菌酯對子囊菌亞門白粉病、半知菌亞門葉斑病有特效。嘧菌酯高效、廣譜，對幾乎所有真菌界的子囊菌亞門、擔子菌亞門、鞭毛菌亞門和半知菌亞門等病害均有良好的活性，但由于該殺菌劑生產上使用普遍，存在抗藥性水平上升、防治效果下降的現象[32]。吡唑醚菌酯防治子囊菌、擔子菌、半知菌和卵菌綱引起的多種病害，同時它又是一種新型殺菌劑，能誘導許多作物的生理變化，增強硝酸鹽（硝化）還原酶的活性提高對氮的吸收，降低乙烯的生物合成，延緩作物衰老，促進作物的生長。可見，甲氧基丙烯酸酯類呼吸抑制劑吡唑醚菌酯也可作為河北省大豆主要真菌病害兼治的首選殺菌劑之一。

由于氣候變化等多種因素的作用，病害的發生逐漸呈現出種類多、頻率高的趨勢，對農業生產的危害日益增強。大豆真菌病害與溫度、濕度及降雨、耕作制度等變化關系密切，因此，隨著各種條件的不斷變化，應及時調查和鑒定田間病害和病原菌種類的發生、發展程度，根據病害的種類合理選用殺菌劑，達到有效防治的目的。

4 結論

河北省大豆主產區致病病原菌分別為木賊鐮孢、大豆炭疽菌、莖點霉菌、鏈格孢、嘴突凸臍蠕孢，對應病害分別為大豆根腐病、炭疽病、莖點霉葉斑病、大豆黑斑病、凸臍蠕孢葉斑病。推薦三唑類甾醇抑制劑、甲氧基丙烯酸酯類呼吸抑制劑吡唑醚菌酯作為河北省大豆主要真菌病害綜合防治的優選兼治藥劑。