木薯渣基質化發酵微生物分離及復合菌配制

王　戰，冷雨茜，郭世榮，孫　錦，夏彭飛，束　勝

木薯渣基質化發酵微生物分離及復合菌配制

王戰1，冷雨茜1，郭世榮1，孫錦1，夏彭飛2，束勝1※

（1. 南京農業大學園藝學院，南京 210095；2. 南京新創蔬菜分子育種研究院有限公司，南京 211800）

為縮短木薯渣發酵周期，提升木薯渣基質產品質量，該研究以木薯渣為試驗材料，對其自然發酵的4個關鍵時期微生物進行分離、鑒定，并探討復合微生物菌對木薯渣的發酵效果。結果表明，從木薯渣發酵初始期、升溫期、高溫期和腐熟期，分別分離出30株、54株、25株和32株菌株。將分離出的菌株接種到剛果紅培養基上，篩選出具有降解木質纖維素功能的菌株54株。采用16S rDNA與內轉錄間隔區ITS測序比對的方法，鑒定出與木薯渣發酵密切相關的微生物37株，其中細菌類主要以高地芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發酵效果最佳，放線菌類、真菌類分別以灰略紅鏈霉菌、綠色木霉菌的效果較好。將上述菌株按比例復配形成微生物菌，發現3種微生物混合后的發酵效果最好，可使木薯渣纖維素質量分數降低到24.4%，且失重率顯著高于商業菌劑。這些結果說明微生物之間通過相互協同作用，進一步促進木薯渣的發酵進程，其中以高地芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、灰略紅鏈霉菌、綠色木霉菌復合發酵效果最好。

發酵；微生物；木薯渣基質；鑒定；復合菌

0 引 言

木薯渣是木薯工業的副產物，含有大量的木質纖維素，自然條件下降解較慢。如不能進行及時處理，會嚴重污染生態環境，成為木薯加工副產物亟需要解決的問題之一。目前，木薯渣的主要用于生產動物飼料、園藝栽培基質、工業原料等方面。雖然木薯渣的處理有很多方法，但這些途徑都存在一定的弊端，如木薯渣制成家禽飼料營養成分難以穩定，而能源化利用時，生產成本又較高等問題，導致生產上還存在大量的木薯渣得不到有效利用。

木質纖維素是影響有機廢棄物發酵進程的關鍵因素。近年來，醋糟、枸杞枝條等有機廢棄物基質化的發酵微生物研究主要集中在纖維素高效降解菌方面[1]。目前，許多具有木質纖維素降解能力的真菌、放線菌和細菌被國內外學者陸續分離篩選出來，并進行堆體發酵試驗。真菌類主要有木霉屬、青霉屬、根霉屬和毛殼菌屬等，放線菌主要有鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬和纖維放線菌等，細菌類主要是芽孢桿菌屬、纖維素單胞菌屬和類芽孢桿菌屬等，這些微生物通過分泌大量游離的胞外纖維素酶來實現纖維素的有效水解；同時，形成的纖維素酶和其他非酶因子之間協同作用，將纖維素分子降解成可溶性的葡萄糖、纖維二糖或纖維寡糖等物質[2-6]。

復合微生物菌劑是目前加快工農業有機廢棄物發酵腐熟最便捷、無害、穩定的一種生物轉化技術，其應用前景非常廣闊[7]。接種外源微生物復合菌劑可以快速提高堆體溫度、調節微生物群落結構、降低氮素損失，提高發酵效率與發酵質量，促進腐熟[8-9]。這是由于微生物多樣性的提高可以保證整個復合微生物群落結構的安全性與穩定性。研究表明，多種微生物復合菌劑可以加快豬糞發酵效率，提高發酵溫度，縮短發酵周期[10]。接種腐稈菌劑改善了稻草育秧基質的理化性狀，可降低基質有機質含量，提高速效養分濃度及減小碳氮比，進而促進秧苗生長[11]。微生物之間也是有關聯的，有的之間表現為協同共生作用，有的表現為拮抗作用，在實際堆體發酵系統中，不同的微生物之間協同作用會有差異[12]。

木薯渣富含植物生長的大量元素和木質纖維素，是制備育苗和栽培基質的理想原料之一。而目前有關木薯渣基質化利用的發酵微生物菌劑研究較少。為此，本研究以自然發酵的木薯渣為原材料，篩選木薯渣發酵過程起關鍵作用的微生物，并將篩選出的單一菌株進行復配，進一步研究復合菌對木薯渣基質發酵進程及效果的影響，以期研發出木薯渣基質發酵的微生物菌劑，為有機固體廢棄物基質化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用的新鮮木薯渣來自江蘇省興化市新土源基質肥料有限公司。新鮮木薯渣含水率為65%，pH值6.1，EC值為5.63 mS/cm；總碳、總氮、全磷和全鉀含量分別為199.9、29.95、10.2和6.5 g/kg；纖維素、半纖維素和木質素分別占木薯渣質量分數的39%、20%和18%。

牛肉膏蛋白胨固體培養基：5 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L NaCl，1 000 mL蒸餾水，18 g/L瓊脂粉，pH值7.4～7.6。改良高氏一號固體培養基：KNO31 g/L，20 g/L可溶性淀粉，0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L NaCl，0.01 g/L FeSO4，18 g/L瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水，pH值7.4~7.6，每1 000 mL培養基中加入3%重鉻酸鉀3.3 mL。馬丁氏培養基：5 g/L蛋白胨，10 g/L葡萄糖，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.1 g/L鏈霉素，0.033 g/L孟加拉紅，18 g/L瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水。高氏一號固體培養基：1 g/L KNO3，20 g/L可溶性淀粉，0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L NaCl，0.01 g/L FeSO4，18 g/L瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水，pH 值7.4～7.6。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L葡萄糖，18 g/L瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水，自然pH值。剛果紅培養基：2 g/L羧甲基纖維素，2 g/L (NH4)2SO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L NaCl，18 g/L瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水，pH值7.0。

以上培養基在滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

1.2 測定方法

1.2.1 微生物分離與純化

木薯渣堆體溫度分別在10:00和16:00時測量，把溫度計插到堆體的前、后、左、右和中心5個位置30 cm處測量，取5個點的均值作為堆體發酵溫度。

根據木薯渣發酵進程，分為4個關鍵階段，當堆體溫度達到27 ℃時為初始期，溫度達到35～45 ℃時為升溫期；高溫期為堆體溫度達到55～60 ℃時，腐熟期為堆體溫度降至27 ℃時。每個時期取樣時，取樣點與堆體溫度測量處相同，均采用5點取樣法，在堆體深30 cm處取樣，之后儲存在4 ℃冰箱中備用。

分離方法：細菌分離用牛肉膏蛋白胨固體培養基，放線菌用改良高氏一號培養基，真菌分離用馬丁氏培養基，3類微生物都運用平板涂布法：1）分批制備樣品的菌懸液：稱取木薯渣樣品10 g，放入含有90 mL無菌水的錐形瓶中，放入搖床震蕩（溫度設置與取樣溫度一致，200 r/min，持續40 min），然后用無菌紗布過濾，吸取1 mL濾液進行梯度稀釋（菌液稀釋度為10-1），加入盛有9 mL無菌水充分混勻，此時菌液稀釋度為10-2，以此類推制成10-2～10-4幾種稀釋度的懸浮菌液。2）涂布：在超凈工作臺中，將培養皿標號，選取10-2、10-3、10-4濃度梯度，每個濃度設置3個重復，然后每個皿放入0.1 mL相應稀釋度的菌懸液，然后用無菌涂布棒將菌液涂開，室溫下靜置8 min。3）培養：在生化培養箱中倒置培養，溫度設置與樣品取樣時標記的溫度一致，細菌培養2～3 d，放線菌與真菌培養6～7 d。

純化方法：采用劃線方法純化，先用接種針挑取生長在涂布平板上清晰完整，且形態顏色特征不同的單菌落，然后涂在新的培養基平板上，用畫Z字形的方法純化。在純化時細菌用牛肉膏蛋白胨固體培養基，放線菌用高氏一號固體培養基，真菌采用馬鈴薯葡萄糖固體培養基。細菌在生化培養箱中倒置培養2～3 d，放線菌和真菌培養5～6 d，連續純化2～3次，最后采用培養基固體斜面法，4 ℃保存。

1.2.2 纖維素分解微生物的篩選

采用纖維素剛果紅培養基篩選具有纖維素分解能力的菌株。1）先將純化的菌種接種到剛果紅培養基中，然后在生化培養箱中倒置培養，培養溫度設置與樣品取樣溫度一致。2）培養6 d后，在長有菌落的剛果紅培養皿中滴加0.3%的剛果紅溶液，搖勻之后靜置染色30 min，用1 mol/L NaCl溶液沖洗剛果紅培養基，來回沖洗5～6次。3）根據培養基中透明圈的有無篩選出目的菌株。

1.2.3 微生物鑒定

采用16SrDNA對篩選出的細菌和放線菌進行序列比對，真菌運用內轉錄間隔區ITS測序比對的方法。

細菌和放線菌基因組提取：挑取待測菌液接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，37 ℃振搖培養過夜，之后運用Springen MagBead Bacteria DNA Kit提取基因組DNA。真菌基因組DNA的提取：挑取待檢菌株接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基，37 ℃振蕩過夜，之后運用Springen MagBead Fungal DNA Kit提取真菌基因組DNA。

細菌和放線菌用合成的16S通用引物，27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。真菌采用合成的18S通用引物：NS1：5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3；NS8：5-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3。

PCR擴增反應體系：在0.2 mL離心管中加入以下成分：1L基因組DNA、25L 2倍Mix Buffer、1L 27F引物（10M）、1L 1492R引物（10M）、22L雙蒸水。混勻后進行PCR反應，先95 ℃預變性5 min，接著95 ℃保持30 s使模板變性，然后將溫度降到55 ℃，保持30 s使引物與模板充分退火；在72 ℃保持90 s，然后72 ℃使引物在模板上延伸7 min，合成DNA，完成1個循環。重復這樣的循環35次。

PCR擴增序列測定與比對：將菌株16SrDNA擴增產物進行測序，得到的序列在NCBI數據庫中進行比對，選擇相似性在98%以上菌株的相關序列進行分析。

1.2.4 復合菌發酵效果試驗

通過前期分別對細菌類、放線菌類、真菌類單一菌進行木薯渣發酵試驗，篩選出細菌類以高地芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，放線菌主要為灰略紅鏈霉菌，真菌類以綠色木霉菌對木薯渣發酵的效果最好。因此，復合菌發酵效果試驗主要以高地芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、灰略紅鏈霉菌和綠色木霉菌為對象。細菌類、放線菌類、真菌類分別在牛肉膏蛋白胨液體培養基、高氏一號液體培養基、馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養5～6 d后，高地芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在600 nm下測OD值，用無菌水將OD值稀釋到1.0后，混合成細菌類菌液；灰略紅鏈霉菌和綠色木霉菌先通過測量菌液中的孢子濃度，分別稀釋到1×107cfu/mL的菌液。根據表1處理進行菌株組合，全部按照1:1等體積混合成菌液，CK采用無菌水替代，取2 mL菌液接種到木薯渣固體培養基中，商業菌劑的添加按照說明書上進行，在28 ℃生化培養箱中靜置培養15 d，然后測量發酵后木薯渣的失質量率、纖維素和半纖維素。

表1 木薯渣發酵復合微生物菌組合配比

注：“1”表示有一份，細菌類1份包括高地芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌2種菌，放線菌類1份僅為灰略紅鏈霉菌，真菌類1份僅為綠色木霉。“-”表示沒有，下同。

Note: “1” means there is one copy. One copy of bacteria includes two species ofand. One copy of actinomycetes is only, and one copy of fungi is only. “-“ means no have, the same as the below.

1.2.5 失質量率、纖維素和半纖維素測定

失質量率采用烘干稱重法，先將發酵的木薯渣轉移到100 mL的離心管中，在28 ℃、270 r/min搖床中振蕩30 min后，28 ℃條件下，9 000 r/min離心10 min，棄上清液，加蒸餾水，重復洗滌3次；棄上清液，將離心管中的木薯渣全部移到玻璃培養皿中，在95 ℃烘箱中烘干2～3 d，烘干至恒質量并稱質量（1），按以下公式計算：

失質量率=((10-1)/10)×100% （1）

纖維素含量采用72%濃硫酸水解法，半纖維素含量采用2 mol/L鹽酸水解法。

2 結果與分析

2.1 木薯渣發酵微生物分離

依據木薯渣發酵過程的4個關鍵階段（初始期、升溫期、高溫期、腐熟期）為時間點進行3大類微生物（細菌、放線菌、真菌）分離，部分分離結果見圖1。細菌菌落特征表現為隆起，且透明規整，表面光滑，但顏色大小各異。放線菌菌落特征為扁平，表面光亮有白色的菌絲。真菌菌落一般為圓形隆起的絲狀，但大小與菌絲顏色、形狀不同。在微生物分離過程中，依據菌落這些大小、顏色、形態特征不同，初始期一共分離30株菌、升溫期54株、高溫期25株、腐熟期32株，具體見表2。

2.2 分離微生物的篩選

將分離的微生物接種到纖維素剛果紅培養基上，依據剛果紅透明圈的有無，篩選具有分解纖維素能力的菌株（圖2）。能分解纖維素能力的菌株，菌株周圍都形成了一個透明圈，其透明圈的大小與分解能力成正相關，而沒有分解能力的菌株，其周圍沒有出現透明圈。經篩選、判斷，共選出具有纖維素降解能力的菌株54株，其中初始期9株、升溫期25株、高溫期9株、腐熟期11株，具體分離的微生物數量見表3所示。純化這些菌株，進一步鑒定分析。

圖1 木薯渣發酵關鍵階段的微生物培養

表2 木薯渣發酵不同階段微生物分離數量

圖2 剛果紅培養基篩選具有分解纖維素能力的微生物

表3 木薯渣發酵不同階段具有分解纖維素能力的微生物數量

2.3 微生物鑒定

經過基因組提取、擴增、測序以及NCBI數據庫比對后，一共鑒定出37株菌，另有標號為AX6、AZ3、BX4、CF3、CF4、CF6、CF7、CF9、CF12、DX2、EF1、EF2、EF3、EF4、FX12、FX13、FF的菌株，沒有鑒定出來。從表4中可以看出鑒定出的37株菌中，細菌大多是芽孢桿菌類，放線菌多為鏈霉菌類，真菌為木霉菌類。

2.4 復合菌發酵效果

如圖3所示，3類微生物菌混合的處理（I-4），木薯渣纖維素含量最低，為24.4%，顯著低于對照處理，其余處理組合纖維素含量之間沒有顯著差異。復合菌處理條件下，木薯渣半纖維素含量顯著低于對照，其中I-1、I-2、I-4和I-6復合菌處理下半纖維素含量均較低，但它們之間沒有顯著差異。I-4處理下木薯渣失重率顯著高于其他處理，與對照相比，增加34.8%。綜上，3類菌制成的混合菌（I-4）處理，對木薯渣發酵效果最好，并好于2種商業菌劑（I-5和I-6）。

表4 微生物鑒定結果

注：每個值都是由3個重復的平均值±標準誤差，柱上不同字母表示處理間差異顯著（P <0.05）。

3 討 論

工農業有機固體廢棄物基質化發酵過程是在微生物的作用下，將難降解的有機物分解成可被植物利用的小分子物質，而參與發酵微生物主要種類有細菌、放線菌和真菌，其中細菌占主導地位，其次是放線菌和真菌[13]。本試驗結果表明，在分離的木薯渣發酵微生物中，細菌數量最多。有機物基質發酵過程中微生物的數量和群落是隨著發酵進程變化而不同，升溫期一般嗜溫微生物非常活躍，它們旺盛的代謝可產生許多熱量，使堆體溫度不斷升高；達到高溫期時，嗜熱微生物開始活躍，主要為耐高溫細菌與放線菌，真菌極少[14-16]。本試驗中，木薯渣發酵在高溫期，分離出的放線菌和真菌數量較少，其中真菌未發現。細菌類主要以耐高溫的菌為主，如高地芽孢桿菌和蒼白氣芽孢桿菌。

對于有機木質固體廢棄物，影響發酵周期長短的關鍵因素是木質纖維的降解。因此，添加木質纖維素降解菌至有機廢棄物中，是縮短發酵周期最經濟、最有效的措施之一，也是當前廢棄物基質化利用研究的熱點[17]。目前，已從自然界中分離篩選出許多具有纖維素降解能力的優良菌株，包括細菌、放線菌和真菌等。本研究將木薯渣4個發酵關鍵時期分離出的微生物，運用纖維素剛果紅培養基平板法，篩選具有纖維素降解能力的菌株，結果發現能降解纖維素的，大多為細菌類，包括芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、小雙孢菌屬、高溫單胞菌屬等，放線菌類一般有鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬、高溫放線菌屬、纖維放線菌屬等，真菌類主要有木霉屬、青霉屬、曲霉屬、毛殼菌屬等。

在工農業有機廢棄物基質化發酵過程中，添加外源微生物菌劑可以提高發酵質量，縮短發酵時間。通常情況下，微生物菌劑分為單一微生物菌劑和復合微生物菌劑，目前，國內外研究與使用最多的是復合微生物菌劑，主要是由于復合微生物菌劑之間的互利共生作用，以及它們的對發酵環境的適應能力比較強。而單一微生物菌劑主要是一些鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬等，它們對發酵環境適應能力比較低[18-19]。本研究中，通過將篩選出的微生物菌株按比例混配形成復合菌，發現發酵微生物之間存在相互協同促進作用，其中4種菌復配形成的微生物菌劑對木薯渣發酵的效果好于其他菌的組合。細菌、放線菌和真菌的混合菌液可以提高發酵降解的效率，這可能是由于每種菌的分解代謝的酶系組分不同，它們之間正好起到互補協同的作用，促進了降解發酵效果[20-21]。

4 結 論

考慮后期混合菌操作的簡便性、有效性，以及用最少的菌種發揮最大的效果，通過將細菌類、放線菌類與真菌類菌株進行復配，發現復合菌發酵效果優于單一菌，其中以I-4處理（高地芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、灰略紅鏈霉菌和綠色木霉）后，木薯渣失質量率較對照（CK）顯著提高了34.8%，而纖維素和半纖維素含量分別下降，對木薯渣發酵效果最好，可用于今后木薯渣基質發酵商業微生物菌劑的制備和生產。

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Isolation and identification of cassava residue substrate fermentation microorganisms and compound bacteria preparation

Wang Zhan1, Leng Yuqian1, Guo Shirong1, Sun Jin1, Xia Pengfei2, Shu Sheng1※

(1.,,210095,;2..,211800,)

Cassava residue is a typical byproduct inacassava industry, containing a large amount of lignocellulose.However, if not treated timely, the cassava residuecanseriously pollute the ecological environment, due toits relatively slow degradationunder natural conditions. It is urgent to properly treatthe byproductsof cassava processingin time. At present, the cassava residue is mainly used in the production of animal feed, horticultural substrates, and industrial raw materials. Nevertheless, there are certain drawbacks in the processingof cassava residues underthese pathways. The lignocellulose is akey factor that affects the fermentation process of organic wastes. In recent years, most microbial studies on the fermentation of organic waste matrixes, such as vinasse and twigs, have focused on the cellulose-efficient degrading bacteria. This study aims to isolate, screen and identifythe microbial strains related to the fermentation of cassava residue from the natural fermentation process, thereby to obtain a composite microbial agent.An emphasis is put on the fermentation of composite microbial agent in the cassava residue matrix. The main results are as follows:Microorganisms were isolated during the four key periods of natural fermentation,including the initial stage (25℃), warming stage (25-40℃), high temperature stage (55-60℃), and decaying stage (25℃). A plate coating method was used to isolate microorganisms at different fermentation stages, where the 30 strains of bacteria were isolated in the initial stage, 54 strains in the warming stage, 25 strains in the high temperature stage, and 32 strains in the rotting stage. Further inoculation of isolated microorganisms onto Congo red medium can contribute to the selection of 54 strains with lignocellulose-degrading functions. 37 microorganisms closely related to cassava residue fermentation were identifiedusing the 16S rDNA and ITS sequencing of inner transcribed spacer region. The combination ofandwas the best fermenting bacterium, while the actinomycetes were the best fermenting bacterium. The red streptomyceteswere the most effective, where thefungi were best with. The strains were further compounded in proportion to form microbial agents.It was found that the mixture of three types of microorganisms had the best fermentation effect,wherethe residue cellulose content was reduced by 24.4%,while,the weight loss was significantly higher than that of commercial agents. These results demonstratedthat there was a certain synergy between microorganisms, and this synergy can contribute to promote the fermentation process of cassava pomace.The compound microbial agents can be recommendedduring this time to achievethe most efficient fermentation,including the,,, and.

fermentation; microorganisms; cassava residue substrate; identification; compound microorganism

王戰，冷雨茜，郭世榮，等. 木薯渣基質化發酵微生物分離及復合菌配制[J]. 農業工程學報，2020，36(21)：266-271. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.21.032 http://www.tcsae.org

Wang Zhan, Leng Yuqian, Guo Shirong, et al. Isolation and identification of cassava residue substrate fermentation microorganisms and compound bacteria preparation[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(21): 266-271. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.21.032 http://www.tcsae.org

2020-07-08

2020-10-12

國家重點研發計劃項目（2019YFD1001900）；中央高校基本科研業務費專項資金資助（KYLH202005）；國家大宗蔬菜產業體系建設專項資金（CARS-23-B12）

王戰，研究方向為設施園藝。Email：1024273853@qq.com

束勝，博士，副教授，研究方向為設施園藝與無土栽培。Email：shusheng@njau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.21.032

TS210

A

1002-6819(2020)-21-0266-06