TaSPX3基因VIGS沉默表達降低小麥對葉銹病(Puccinia recondite f. sp. tritici)的抗性

張 蕊 李 博 李 旭 尚文靜 韓迎春 程 琨 劉 娜* 鄭文明，*

(1.河南農業大學 生命科學學院，鄭州 450002；2.河南農業大學 小麥玉米作物學國家重點實驗室/河南糧食作物協同創新中心，鄭州 450002)

葉銹病是小麥三大銹病之一，是由葉銹菌(Pucciniareconditaf. sp.tritici)引發的一種病害，其分布范圍廣、發生頻繁，每年在全世界各個小麥種植區大面積流行，對小麥產量造成嚴重損失[1]。為抵御病原物的攻擊，植物進化出復雜的信號感知、傳導和抵抗機制，例如在無毒性病原體感染過程中，植物抗性蛋白識別病原體的效應因子,并在感染部位啟動超敏反應(HR)和局部程序性細胞死亡，超敏反應包括活性氧(ROS)爆發、信號分子的傳遞及病程相關蛋白(PR)的誘導等[2]。過多的ROS積累會破壞細胞膜結構和功能，而細胞中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等可使ROS維持在正常水平[3]。抗病品種小麥受到稻瘟病感染后，活性氧爆發程度低于感病品種，CAT活性僅在抗病品種中升高，而其他活性氧清除酶(SOD、POD、APX)活性在不同抗性小麥中都有所升高，在抗病小麥中的增幅大于感病小麥，表明在去除稻瘟病菌感染引起的過量活性氧累積過程中，有效的活性氧清除系統能夠抑制真菌對細胞的損傷，從而有助于增強小麥抗病性[4]。

植物在受到某些病原物侵染時，會誘導病程相關蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)的表達，PR蛋白多為酸溶性、低分子量和抗蛋白酶分子，有助于植物在苛刻的條件下生存，大多數PR蛋白具有抗菌、殺蟲和抗病毒活性，有些PR蛋白還具有β-1，3-葡聚糖酶或幾丁質酶活性[5]。病程相關蛋白基因PR1、PR2、PR5是植物抗病基因介導的抗病反應中的標志基因[6]，相關小麥抗病性的研究主要有：白粉菌侵染小麥顯著誘導了小麥中病程相關蛋白PR1、PR2、PR5的轉錄表達[7]。條銹菌的致病因子Pst-milR1可通過抑制PR2的表達來抑制植物的免疫應答反應[8]。王華忠等[9]研究發現，小麥抗病反應過程中的2個重要的PR蛋白基因(幾丁質酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因)對白粉病菌入侵和吸器形成均有抑制作用，在一定程度增強了小麥對白粉病菌的抗性。

病毒誘導基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技術在植物抗病研究中被廣泛應用，該技術是基于轉錄后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing, PTGS)，可引起內源mRNA特異性降解，其原理是在病毒載體中插入特異性目的片段，侵染宿主植物后，植物表現出目的基因表達水平下降或基因功能喪失[10]。利用VIGS技術可在相對快速的時間內沉默目的基因，該技術已被用于單子葉植物和雙子葉植物中[11]。大麥條紋花葉病毒誘導的基因沉默(BSMV-VIGS)系統最初是在大麥上被開發出來，現在廣泛應用于研究小麥的基因功能[12]。王新博等[13]利用BSMV-VIGS系統沉默小麥TaEF-1α基因，與正常植株相比，VIGS沉默處理后的植株對干旱脅迫更加敏感，因此TaEF-1α基因可能在小麥干旱脅迫響應中發揮關鍵作用，Feng等[14]利用VIGS技術沉默TaMDHAR4基因后發現，小麥受到條銹菌感染部位壞死面積比例增加，對條銹菌的抗性受到了抑制。

本實驗室前期在對接種葉銹菌后的小麥轉錄組數據分析中發現，TaSPX3基因的轉錄水平受到葉銹菌侵染誘導，推測TaSPX3基因可能參與小麥抗葉銹病過程。TaSPX3基因屬于SPX基因家族,該基因家族共有結構域最早是從酵母gpa1抑制子(SYG1)、酵母周期依賴性蛋白(PHO81)和人的異嗜性多變逆轉錄病毒受體(Xpr1)中發現的，因此以這三者首字母命名。SPX蛋白結構域較為保守，平均長度為165個氨基酸，組成3個亞結構域，每個亞結構域由30～40個氨基酸組成，3個亞結構域的序列相似性較低。SPX基因家族通常在維持細胞內磷穩態中發揮著重要作用，參與植物低磷脅迫應答[15]。研究發現小麥SPX基因可能參與小麥高溫抗條銹病[16]。目前關于TaSPX3參與小麥抗葉銹病過程的作用機制研究尚未見報道，因此，為深入了解TaSPX3基因在小麥抗葉銹病中的作用，本試驗擬采用BSMV-VIGS系統沉默中國春和鄭麥9023中TaSPX3基因，在沉默植株上接種葉銹菌，并利用qRT-PCR技術對TaSPX3的表達水平進行檢測，觀察小麥對葉銹菌侵染的反應，檢測小麥抗病相關基因PR2、CAT的表達水平，以期為進一步明確TaSPX3的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為中國春和鄭麥9023；供試煙草品種為本生煙；供試菌株為小麥葉銹菌(Pucciniareconditaf. sp.tritici)HnZU18-3單孢系，該菌系由本實驗室鑒定并保存。

1.2 構建大麥條紋花葉病毒介導的TaSPX3基因沉默體系

本試驗中所用載體有α、β、γ和γ-PDS，載體由河南農業大學農學院王道文教授課題組提供。TaSPX3基因cDNA全長789 bp，由本實驗室前期從鄭麥9023中克隆得到。從TaSPX3基因cDNA上選取122 bp的特異性序列作為VIGS的靶標序列，設計特異性引物(表1)，從實驗室已有的TaSPX3-T重組質粒中克隆出帶有LIC接頭的目的片段，利用T4 DNA連接酶將目的片段與線性化γ載體(限制性內切酶ApaⅠ處理)連接，連接產物轉化大腸桿菌，設計引物VIGS-Test-F/R(表1)進行菌落PCR篩選陽性克隆，送至公司測序驗證陽性克隆，重組質粒命名為γ-TaSPX3。

分別將γ (Empty vector)、γ-PDS、γ-TaSPX3 3種質粒與α、β 按照1∶1∶1的比例混勻，組裝成BSMV∶EV、BSMV∶PDS、BSMV∶TaSPX3 3種VIGS病毒，利用煙草轉染方法，沉默中國春和鄭麥9023中的基因[17]，由于本實驗室前期研究發現中國春和鄭麥9023對葉銹病的抗性不同，鄭麥9023對葉銹病的抗性比中國春強，因此選擇這兩個品種小麥來進行研究。接種BSMV∶PDS的小麥用于驗證本試驗所用的BSMV-VIGS沉默體系是否有效，PDS基因是小麥八氫番茄紅素脫氫酶基因，若該基因被沉默，小麥葉片則會出現白化。接種BSMV∶TaSPX3的小麥為試驗組，用于研究TaSPX3基因被沉默后小麥對葉銹菌的抗性。接種BSMV∶EV的小麥中沒有沉默任何基因，作為以上兩種小麥的對照。VIGS病毒接種于小麥第二片葉，接種14 d后，觀察接種BSMV∶PDS的小麥葉片出現白化現象，再將實驗室保存的葉銹菌孢子均勻灑在接種BSMV∶EV和BSMV∶TaSPX3的小麥葉片上，在接種銹菌后的第7 天，觀察小麥葉片感病表型，分析TaSPX3基因沉默對小麥抗病性的影響。

1.3 qRT-PCR

沉默植株和對照組接種葉銹菌后0、12、24 h分別取樣，利用Trizol Reagent(康為世紀生物科技有限公司，CW0580S，北京)提取樣品RNA，利用HiScriptⅡQRTsuperMix for qPCR(南京諾唯贊醫療科技有限公司, 223-01，南京)試劑盒，按提供的操作流程，將RNA反轉錄成cDNA。以小麥26S為內參基因，檢測TaSPX3基因和小麥抗病相關基因PR2、CAT的相對表達量，檢測TaSPX3基因的沉默效果，分析TaSPX3基因沉默對抗病相關基因轉錄水平的影響。用于熒光定量的引物見表1。

目的基因的相對表達水平按照2-ΔΔCT方法計算，每組試驗進行3 次獨立的生物學試驗，利用T-test方法對結果進行顯著性分析。

表1 本試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 VIGS重組質粒的構建

以TaSPX3-T重組質粒為模板，利用引物VIGS-122-F/R 進行PCR反應，克隆得到122 bp的特異性靶標序列，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對PCR產物進行回收，將回收產物與線性化的γ載體連接，連接產物轉化大腸桿菌，挑選單克隆菌落，利用引物VIGS-test-F/R 篩選陽性克隆，將陽性克隆送至公司測序后，與靶標序列比對完全一致，表明重組質粒構建成功。

2.2 BSMV-VIGS沉默體系有效性驗證

為驗證本試驗所用的BSMV-VIGS體系是否有效，對2 種小麥接種BSMV∶PDS病毒，以沉默小麥葉片中的PDS基因，并與接種BSMV∶EV病毒后的小麥葉片作對照，結果見圖1。如圖1所示，中國春和鄭麥9023中接種BSMV∶PDS的小麥葉片均出現白化現象，表明本試驗所用的BSMV-VIGS沉默體系能夠有效沉默小麥基因。

圖1 分別接種BSMV∶EV和BSMV∶PDS的小麥葉片表型Fig.1 Phenotypes of wheat leaves respectively inoculated with BSMV∶EV and BSMV∶PDS

2.3 TaSPX3基因沉默效果檢測

為進一步驗證TaSPX3基因是否被有效沉默，利用qRT-PCR技術檢測感染VIGS病毒的中國春和鄭麥9023接種葉銹菌后的0、12、24 h葉片中TaSPX3基因的表達水平，結果如圖2所示：在2種遺傳背景下，與感染BSMV∶EV的小麥相比，感染BSMV∶TaSPX3病毒的小麥在接種葉銹菌后的0、12、24 h，TaSPX3基因的表達水平均顯著降低，表明接種BSMV∶TaSPX3病毒有效沉默了中國春和鄭麥9023中的TaSPX3基因。

*為顯著差異P<0.05，**為極顯著差異P<0.01。* Significant difference P<0.05，** Extremely significant difference P<0.01.圖2 感染VIGS病毒的中國春(a)和鄭麥9023(b)接種葉銹菌后TaSPX3基因相對表達水平Fig.2 Relative expression level of TaSPX3 after inoculation of leaf rust in Chinese Spring (a) and Zhengmai 9023 (b) infected with VIGS virus

2.4 基因沉默后小麥抗病性研究

為進一步研究TaSPX3基因在小麥抗葉銹病中的作用，給野生型和感染VIGS病毒小麥接種葉銹菌，7 d后觀察葉片感病表型(圖3)。如圖3所示，2 種遺傳背景下，感染BSMV∶TaSPX3病毒的小麥葉片明顯比野生型小麥和感染BSMV:EV的小麥葉片上產生更多的葉銹菌孢子，表明TaSPX3基因沉默的小麥對葉銹病的抗性降低。

圖3 野生型小麥和感染VIGS病毒的小麥接種葉銹菌后葉片表型Fig.3 Leaf phenotypes of wild-type wheat and wheat infected with VIGS virus inoculated with leaf rust

接種銹菌后0、12、24 h檢測了6 個小麥抗病相關基因的表達量，其中PR2和CAT的表達量差異顯著。如圖4(a)所示，感染BSMV∶EV中國春的PR2基因在接種銹菌12 h時顯著上調，而感染BSMV∶TaSPX3中國春的PR2基因在24 h時才顯著上調，中國春中TaSPX3基因被沉默后接種葉銹菌，PR2基因的表達受到了抑制；如圖4(b)所示，感染BSMV∶TaSPX3鄭麥9023接種葉銹菌后PR2基因的表達顯著低于感染BSMV∶EV的鄭麥9023，表明TaSPX3基因的沉默顯著抑制了鄭麥9023中PR2的表達；如圖4(c)、(d)所示，在2種遺傳背景下，CAT基因在感染BSMV∶TaSPX3小麥中的表達量顯著低于感染BSMV∶EV的小麥，表明中國春和鄭麥9023中TaSPX3基因的沉默使葉銹菌侵染后CAT基因的表達顯著下調。

(a) 中國春 PR2基因；(b) 鄭麥9023 PR2基因；(c) 中國春 CAT基因；(d)鄭麥9023 CAT基因。(a) PR2 in Chinese Springt; (b) PR2 in Zhengmai 9023; (c) CAT in Chinese Spring; (d) CAT in Zhengmai 9023;*為顯著差異P<0.05，**為極顯著差異P<0.01。* Significant difference P<0.05，** Extremely significant difference P<0.01.圖4 感染VIGS病毒的小麥接種葉銹菌后PR2和CAT基因相對表達水平Fig.4 Relative expression levels of PR2 and CAT in wheat infected with VIGS virus inoculated with leaf rust

以上研究結果表明，TaSPX3基因沉默抑制了抗病相關基因PR2、CAT的表達，從而降低了小麥對葉銹菌的抗性，因此TaSPX3基因正調控小麥對葉銹病的抗性。

3 討論與結論

病程相關蛋白廣泛存在于不同植物中，是植物防御反應中的重要成員。其中PR2是β-1,3-葡聚糖酶，能夠催化β-1,3-葡聚糖多聚體水解，可直接攻擊入侵菌絲壁，并且它催化的水解產物可以作為信號分子，進一步誘導防御，從而增強植物抗病性[18]。信號分子水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)均能誘導PR2基因的表達，有研究顯示PR2可能通過SA和ABA介導的信號通路參與小麥抗葉銹病反應[19]。本研究中TaSPX3基因的沉默抑制了PR2的轉錄表達，表明TaSPX3基因可能通過調控PR2的表達影響入侵菌絲在寄主細胞內的生長，誘導植物防御反應，從而調控植物的抗病性。

植物細胞氧化還原過程是由復雜的遺傳網絡調控，過氧化氫酶(CAT)是最重要的活性氧清除酶之一，CAT在清除各種代謝途徑產生的H2O2積累方面發揮重要作用[20]。高芬等[21]將拮抗菌制成液體培養基，黃瓜、西瓜、青椒3 種植物經拮抗菌液體培養基處理后，其中CAT和β-1,3-葡聚糖酶活性明顯提高，增強了植物抗病性。本研究利用BSMV-VIGS體系在中國春和鄭麥9023這2種遺傳背景下沉默小麥基因，構建了BSMV∶EV、BSMV∶PDS、BSMV∶TaSPX3 3種VIGS病毒，接種BSMV∶PDS的小麥葉片出現白化現象，表明該體系能夠有效沉默小麥基因；通過qRT-PCR方法檢測TaSPX3基因的相對表達量，發現感染BSMV∶TaSPX3的小麥中TaSPX3基因表達水平顯著低于對照組，表明BSMV-VIGS體系有效沉默了TaSPX3的表達。對感染BSMV∶TaSPX3的小麥接種葉銹菌，觀察到BSMV∶TaSPX3小麥葉片上銹菌孢子堆相比于對照組顯著增多，檢測了多個抗病相關基因表達水平后發現PR2和CAT的表達水平在基因沉默植株中明顯受到了抑制，表明沉默TaSPX3基因可抑制PR2和CAT的表達，可能是降低小麥對葉銹菌的抗性的途徑。如圖3所示，鄭麥9023對葉銹菌的抗性比中國春強，但在2 種遺傳背景下，TaSPX3基因沉默后，都降低了對葉銹菌的抗性，PR2和CAT的表達均受到了抑制，表明TaSPX3基因增強小麥對葉銹病的抗性并無品種間的差別，可能具有廣譜抗性。

本研究表明，TaSPX3基因可能正調控PR2、CAT并參與小麥對葉銹病的抗性機制。研究結果為下一步深入闡明TaSPX3基因在調控小麥抗病機制中的作用提供了基礎。