褪黑素對內蒙古絨山羊皮膚上皮細胞增殖及wnt10b和β-catenin基因表達的影響

吳子賢 吳 靜 宮文典 盧澤宇 趙飛飛 劉俊陽 楊德智> 張燕軍 蘇 蕊 趙艷紅* 劉佳森

(1.內蒙古農業大學 動物科學學院，呼和浩特 010018；2.內蒙古自治區農牧業科學院 畜牧研究所，呼和浩特 010031；3.內蒙古烏蘭察布市商都縣職業技術學校，內蒙古 烏蘭察布 013450)

內蒙古絨山羊的絨毛為重要動物經濟產物，在眾多動物纖維中，山羊絨因其良好的御寒功能和極好的柔軟親膚性，受到廣大消費者的喜愛，被贊譽為“纖維皇后”。羊絨的產量和形態變化與毛囊的發育周期以及組織結構緊密相關。毛囊分為初級毛囊與次級毛囊，次級毛囊由初級毛囊分化而來[1-2]，絨山羊毛囊的周期變化一般指次級毛囊的季節性再生過程，一般而言，次級毛囊經歷生長期(4～11月)、退行期(12月至次年1月)和休止期(2～3月)3個時期[3-4]。毛囊生長發育受眾多信號通路同時作用的調控，其中Wnt信號通路在毛囊生長發育和分化中起到重要作用[5-7]。Wnt分泌蛋白可刺激細胞中多種信號通路，作為生長調節因子在細胞增殖、分化以及遷移中發揮重要作用，許多研究證實經典Wnt/β-catenin信號通路對毛囊生長起決定性作用[8-10]。Wnt10b作為通路中的核心影響因子[11]，在小鼠與兔子的表皮中均有大量表達[12-13]，多項研究證實Wnt10b在內蒙古絨山羊皮膚中也有大量表達[14-15]，毛囊形成來自大量上皮細胞、成纖維細胞在表皮和真皮間凝結，最終的真皮凝結物又稱為乳頭細胞，毛乳頭細胞的多少與絨毛產量密切相關[16]。β-catenin是一種胞內糖蛋白，具有雙重功能，當細胞無Wnt信號時，其與細胞膜上鈣粘附蛋白產生粘附作用，坐落在細胞骨架蛋白上，對同型細胞起到粘附作用[17]。Reddy 等[18]在小鼠皮膚毛囊發育的研究中，通過原位雜交技術確定了Wnt/β-catenin的表達區域，并證實了其對毛囊不同時期分化與發育的作用。

褪黑素是一種吲哚激素，有白天低夜晚高的周期節律性變化，且在多種哺乳動物體內驗證褪黑素可通過縮短毛囊周期變化從而增加毛囊生成數量，以此提高絨毛產量。麗春[19]研究表明，在內蒙古絨山羊體外埋植褪黑素能有效縮短絨毛周期，可提早2個月生絨，并伴有二次生絨現象。劉影等[20]研究顯示，對內蒙古絨山羊體外2次注射2 mg/kg褪黑素可使絨毛長度有所增加。還有研究表明，褪黑素對山羊毛囊干細胞[21]和內蒙古絨山羊成纖維細胞[22]有促進分化和增殖作用。綜上所述，褪黑素能夠促進絨山羊絨毛生長，提高絨毛產量，但其分子調控機制尚不清楚。因此，本研究選用內蒙古絨山羊為動物模型，研究褪黑素對內蒙古絨山羊皮膚上皮細胞增殖及對Wnt10b和β-catenin基因表達的影響，旨在通過體內和體外試驗來探究毛囊形成的分子機制，為揭示內蒙古絨山羊刺激毛囊的生成分子機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗于2018年11月—2019年11月在內蒙古自治區動物遺傳育種與繁殖重點實驗室進行，每月中旬自內蒙古土左旗金萊牧業白絨山羊種羊場采樣，選取三只健康狀態良好的1歲小羊，在耳端去毛后酒精消毒剪取0.5 cm2耳組織，3 h內帶回實驗室處理，使用酶消化法培養原代上皮細胞，一部分傳代培養后試驗處理，一部分凍存備用。

1.2 試劑

DPBS(Hyclone)；0.25%胰酶(Gibco)；高糖培養基DMEM/F12(含丙酮酸鈉，不含hepes，Hyclone)；青霉素和鏈霉素(雙抗，Gibco)；BI胎牛血清(Biological Industries)； DMSO(日本和光劑)；褪黑激素(M5250，Sigma)；TransDetect Cell Counting Kit(CCK-8,TransGen Biotech)；總RNA提取試劑盒(TIANGEN)；熒光定量染料(RR820A，Takara)；實時定量PCR試劑(KT201-12，TIANGEN)；反轉錄試劑盒(RR047A，Takara)；DNA Maker DL500(3590A,Takara)；ELISA試劑盒(上海撫生生物科技有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1內蒙古絨山羊皮膚上皮細胞培養

將選取的絨山羊皮膚酒精消毒30 s，重復3遍，PBS沖洗3遍放入細胞專用操作臺，在60 mm培養皿中去除表皮碎毛，PBS再次沖洗3遍，放入 1.5 mL 無菌無酶離心管中，用剪刀迅速剪碎至0.1 mm2，將碎塊轉移至細胞培養皿后，加入適量預熱好的0.1%胰酶，37 ℃處理30 min，所得消化液用鋼篩過濾，濾液1 500 r/min離心10 min，最終得到細胞沉淀加入新鮮細胞培養液，靜置于培養皿中貼壁培養3 d以上，直至原代細胞覆蓋率達70%以上，方可進行傳代培養。

1.3.2褪黑素對皮膚上皮細胞增殖的影響

用第3代細胞接種至96孔板(約1×104個細胞，每孔100 μL細胞培養液)。使用無水乙醇將褪黑素溶解，并將其配置為 0、100、300、600、900 pg/mL 5個質量濃度，每組10孔細胞，貼壁生長3 d后，每個細胞培養孔中均加入CCK-8 10 μL，37 ℃處理2 h，使用Bio-Tek酶標儀檢測細胞450 nm處吸光度值(OD值)，重復3批細胞得到3組OD值，最后使用Duncan法進行生物學統計計算。

1.3.3褪黑素對絨毛相關生長基因表達量的影響

細胞接種至6個錫紙包裹的培養瓶中，貼壁12 h后梯度添加褪黑素(0、100、300、600、900 pg/mL)，處理48 h后提取RNA，并反轉錄成cDNA用于qRT-PCR檢測Wnt10b和β-cateninmRNA表達量。

1.3.4總RNA提取、cDNA合成及PCR擴增

根據GenBank中公布的山羊Wnt10b和β-catenin基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件做引物設計，以β-actin為內參基因。由上海生物工程公司完成引物合成，選擇內參基因為β-actin并做普通PCR擴增，選擇Taq PCR Mastermix kit(TIANGEN)試劑盒，循環條件為：預變性(95 ℃、5 min)，變性(95 ℃、30 s)，退火(60 ℃、30 s)，延伸(72 ℃、10 min)；產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，對擴增條帶大小和亮度進行分析。引物序列和PCR退火溫度見表1。

表1 基因擴增引物序列Table 1 Primer sequences for PCR of cashmere goat gene

1.3.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

對0、100、300、600和900 pg/mL褪黑素的細胞中的Wnt10b和β-catenin基因進行相對定量分析。每個待測樣本設置3個重復，以β-actin為內參，采用2-ΔΔct法計算分析數據。使用A7500實時熒光定量PCR儀(Agilent)檢測，反應條件如下：95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，退火溫度、30 s，72 ℃、30 s，進行40個循環。反應體系為20 μL，包含10 μL TB Green Premix Ex TaqⅡ、2 μ L cDNA、0.8 μL上下游引物、0.4 μL ROX、6 μL ddH2O，所有反應試劑添加均在冰上進行。

1.3.6皮膚上皮細胞中Wnt10b和β-catenin蛋白表達量測定

使用上海撫生生物科技有限公司生產的Wnt10b(FS16431)和β-catenin(FSK10413)的ELISA試劑盒，對添加0、100、300、600和900 pg/mL褪黑素的細胞中Wnt10b和β-catenin蛋白的質量濃度檢測，試驗前將準備好的5板細胞中去除培養基，使用預冷PBS清洗3～5遍，將加入PMSF的蛋白提取液加入細胞培養孔中，冰浴保持，每隔30 s晃動一次，總計10 min，所得液體移入離心管，離心所得上清用于ELISA法檢測2種蛋白濃度。

1.4 統計分析

本試驗數據先用Excel 2010預處理，試驗結果用平均值±標準誤表示，之后采用SPSS 25.0軟件中的單因素ANOVA方差檢驗分析，使用LSD法對不同質量濃度褪黑素作用于細胞增殖以及Wnt10b和β-cateninmRNA和蛋白表達量進行比較。P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 褪黑素對上皮細胞增殖影響

由圖1可知，與對照組相比，添加100和 300 pg/mL 褪黑素組細胞均顯著增殖(P<0.05)，其中300 pg/mL增殖效果最佳，而600和900 pg/mL細胞密度有所減少。由圖2可知，100 和300 pg/mL均可促進細胞增殖，其中300 pg/mL差異顯著(P<0.05)，高質量濃度褪黑素(600和900 pg/mL)對細胞增殖無顯著促進效應。

圖1 不同質量濃度褪黑激素對絨山羊皮膚上皮細胞增殖影響(×100)Fig.1 Effects of different concentrations of melatonin on proliferation of skin epithelial cells in cashmere goats (×100)

*差異顯著(P<0.05)，**差異極顯著(P<0.01)，下同。NC為無細胞的細胞培養液組。* represents significant difference at P<0.05, ** represents significant extreme difference at P<0.01. The same below. NC indicates cell culture medium without cell.圖2 褪黑素對皮膚上皮細胞增殖的影響Fig.2 Effect of melatonin on skin epithelial cell proliferation

2.2 褪黑素對皮膚上皮細胞生長曲線的影響

不同濃度褪黑激素對內蒙古絨山羊皮膚上皮細胞的增殖的影響見圖3，所有試驗組細胞均符合細胞“S”型生長曲線，第5天為細胞倍增時間，在第5和6天(細胞指數增長期)300 pg/mL組與對照組相比，顯著促進細胞增殖(P<0.05);其他試驗組細胞影響變化無顯著性(P>0.05)。結果表明，高質量濃度褪黑素(600和900 pg/mL)對細胞增殖無顯著促進作用，且皮膚上皮細胞增殖對褪黑素濃度有一定依賴性。

圖3 不同質量濃度褪黑素對皮膚上皮細胞的生長曲線Fig.3 Growth curves of different concentrations of melatonin on skin epithelial cells

2.3 褪黑素對皮膚上皮細胞Wnt10b和β-catenin表達量的影響

RNA反轉錄合成cDNA，用于β-actin、Wnt10b和β-catenin實時熒光定量檢測中， qRT-PCR結果見圖4，各試驗組中，300 pg/mL處理的細胞的Wnt10bmRNA和β-cateninmRNA表達量較對照組均極顯著增加(P<0.01)。結果表明適宜的褪黑素可通過Wnt信號通路增加Wnt10bmRNA和β-catenin基因表達量。

圖4 褪黑素對皮膚上皮細胞wnt10b和β-catenin基因表達量的影響Fig.4 Effect of melatonin on the expression of Wnt10b and β-catenin gene

2.4 褪黑素對皮膚上皮細胞中Wnt10b和β-catenin蛋白的影響

ELISA試劑盒檢測上皮細胞中Wnt10b和β-catenin 蛋白水平，結果見圖5，培養基中添加 300 pg/mL 褪黑素時Wnt10b和β-catenin 2種蛋白均極顯著性上調(P<0.01)，而100和600 pg/mL的作用相對300 pg/mL較弱，但也有著顯著性上調作用(P<0.05)，此結果相較RNA水平結果有些差異；900 pg/mL的作用在蛋白水平依然不顯著，說明900 pg/mL褪黑素對皮膚上皮細胞無增殖作用，且過高濃度反而抑制了細胞增長。

圖5 褪黑素對皮膚上皮細胞Wnt10b和β-catenin 蛋白表達量的影響Fig.5 Effect of melatonin on the expression of Wnt10b and β-catenin protein

3 討 論

褪黑素在松果體中通過一系列酶促反應生成，攝取的必需氨基酸-色氨酸通過色氨酸羧化酶生成羥基色氨酸，最后脫羧并被羥基-吲哚甲基化生成這一吲哚激素[23]。因褪黑素有自由基的清除能力，以刺激DNA修復，具有代謝能力和增殖能力，生長期的毛囊可在褪黑素的作用下進行細胞保護和凋亡抑制[24]。褪黑素作為細胞增殖、分化的重要影響因素，通過與其受體的結合發揮作用，褪黑素受體MT1、MT2和RORα分布廣泛，在人的毛乳頭角質細胞和真皮乳頭成纖維細胞中檢測出MT1，而毛囊中主要生成黑色素的黑素細胞中確未檢測到MT2[25]，但在絨山羊中卻能檢測到MT2、RORα受體位點[26]，蛋白受體在Wnt、FGF、Notch和Shh等信號通路中發揮作用，在人體中通過激活AMPK/β-catenin信號通路促進間充質細胞的成骨化[27]。內蒙古絨山羊毛囊中外根鞘的核受體RORα被外源褪黑素磷酸化后，受體可介導內蒙古絨山羊皮膚成纖維細胞中Wnt/β-catenin通路被激活[28]。有研究表明，小鼠絕育后因卵巢的缺失而進入“更年期”，雌激素減少對皮膚有負面影響，而體內注射褪黑素治療后，小鼠皮膚中β-catenin表達量增加，表皮干細胞和真皮干細胞中β-catenin顯著性增加，皮膚變厚[29]。本研究是在前人研究基礎上篩選出在毛囊發育中有重要作用的2個基因，毛囊發育中促進毛囊生成的Wnt10b及黏附細胞作用的β-catenin，通過對其表達量的檢測反映褪黑素對內蒙古絨山羊上皮細胞增殖的正向調控。這與麗春[19]在內蒙古絨山羊中埋植褪黑素促進wnt10b和β-catenin基因表達的結果一致。

因褪黑素有避光性，動物體內褪黑素分泌量的變化受到陽光影響較多，故直接埋植褪黑素到動物皮膚中方法無法高效觀察到皮膚絨毛變化，一般埋植試驗周期設為1年，耗時久且對動物身體影響因素過多。而動物體外培養細胞中可在短期內高效得到結果、多次驗證結果，但體內注射褪黑素試驗優勢在于，動物體內被影響因素多種多樣，可能有促進作用也可能有抑制作用，而體外細胞試驗中，單一的細胞環境可以一一驗證褪黑素的作用。本研究中褪黑素加入后，細胞生長第3天時細胞均出現指數增長期。內蒙古絨山羊體內埋植褪黑素后，絨毛周期變短，毛長有所增加[28]，因此不同動物和不同器官組織中褪黑素的作用不同。本試驗設計階梯濃度的褪黑素對內蒙古絨山羊皮膚上皮細胞增殖產生的作用，結果顯示，不同濃度褪黑素對細胞增殖效果不一，合適的褪黑素濃度對上皮細胞增殖效應顯著，試驗組中 300 pg/mL為該激素的最佳促進細胞增殖作用質量濃度，過高質量濃度的褪黑素(900 pg/mL)對細胞增殖無促進作用，該效應亦通過Wnt10b與β-catenin基因表達量證實，此結論與趙德超等[29]在絨山羊體內褪黑素作用效果不同的研究結果一致。

4 結 論

不同濃度的褪黑素對內蒙古絨山羊皮膚上皮細胞增殖及對Wnt10b和β-catenin基因表達有不同的影響，300 pg/mL為該激素的最佳促進細胞增殖作用質量濃度，還顯著提高絨毛發育相關生長基因Wnt10b及β-catenin的表達量，過高濃度的褪黑素對細胞增殖無促進作用，研究表明褪黑素可能通過影響Wnt10b/β-catenin對細胞產生增殖作用，為進一步研究通路中其他相關基因奠定基礎，調控絨毛生長周期的機制尚需進一步研究。