酵母固定化技術(shù)在燃料乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用

劉利 中糧生物科技股份有限公司

固定化技術(shù)是在水不溶性載體上穩(wěn)定和重復(fù)使用生物催化劑（細(xì)胞或酶）。固定化酵母可以提高反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)胞的濃度，加速發(fā)酵，同時相比傳統(tǒng)的游離細(xì)胞，底物和產(chǎn)物以減少對細(xì)胞的影響。持續(xù)發(fā)酵、循環(huán)利用、減少發(fā)酵的數(shù)量和生產(chǎn)成本；發(fā)酵周期縮短和生產(chǎn)力提高。固定化酵母技術(shù)也有局限性，如限制酵母的傳播，用固體營養(yǎng)物質(zhì)抑制酵母，但從長遠(yuǎn)來看，乙醇生產(chǎn)具有很高的增長潛力。

一、酵母固定化技術(shù)

根據(jù)酵母細(xì)胞的固定化方法，有吸附、包埋、膜隔離、絮凝法。根據(jù)固定化是否需要載體，可以將其分為載體和無載體固定化方法。

1.吸附法。在吸收方法中，酵母細(xì)胞通過其自身的靜力、疏水或與支共價的功率吸附在面上。由于酵母在載體表面形成膜，因此生物膜法中使用的載體大多是高纖維、高粱渣、橘皮等。對酵母沒有毒性作用。另一方面，酵母細(xì)胞和載體表面和本身都是有基因的，但不是用來抑制酵母的生長。但酵母和細(xì)胞層的產(chǎn)生卻不是自發(fā)，因為酵母厚度不均勻。此外，酵母干細(xì)胞容易減少，因為吸收力較低，酵母與載體之間沒有障礙。因此，有必要進(jìn)一步研究酵母干細(xì)胞的表面特性和吸收機(jī)制，以優(yōu)化其吸收性能。

2.包埋法。是一種固定化多孔細(xì)胞或復(fù)合材料的方法。細(xì)胞固定化有兩種主要類型：多孔物質(zhì)中細(xì)胞的增加和多端口材料中真菌的產(chǎn)生，最終受到空間限制。聚氨酯泡沫塑料、泡沫塑料、沸點和陶瓷是常見的固體材料。另一種方法是在親水性聚酰胺中將細(xì)胞包裹。所選塑料材料包括透明氯化鈉、瓊脂、角叉（菜）膠、聚丙烯酰胺等。包埋法減少了基本產(chǎn)品和產(chǎn)品對酵母的抑制，也減少了酵母中的分裂細(xì)胞數(shù)量，因為酵母可以準(zhǔn)確地包埋介質(zhì)，但是，細(xì)胞儲存常常會阻礙傳統(tǒng)的酵母代謝，變化包埋介組織結(jié)構(gòu)周期、基本模式的傳播和酵母的分布。此外，包埋介質(zhì)費用昂貴，難以回收。

3.膜隔離。一種固定的方法，可使用半透明酶將細(xì)胞從發(fā)酵中分離出來。當(dāng)球狀制造分離時，它被稱為微膠囊，由于傳質(zhì)瓶頸、膜堵塞和生產(chǎn)成本高，使用的乙醇較少。但是，一些研究者也進(jìn)行了研究。

4.絮凝法。是一種固定化無載體方法，絮凝顆粒利用細(xì)胞間吸附形成。關(guān)于絮凝機(jī)制，絮凝是一個不可逆和無菌的過程。絮凝機(jī)理可分為兩類：第一類是細(xì)胞表面的團(tuán)聚體和相鄰細(xì)胞表面的甘油相結(jié)合形成的絮凝；另一種是由于吸附在細(xì)胞表面或疏水肽引起的絮凝，用絮凝劑編碼的酵母表面蛋白與絮凝效果有關(guān)。人們還發(fā)現(xiàn)，自然界酵母菌株FLO1 基因仍處于快速進(jìn)化階段。此外，對于某些低絮凝性或低絮凝性酵母，有時可以添加助凝劑或交聯(lián)劑，以促進(jìn)絮凝，這種方法稱為交聯(lián)法。自絮凝形式的無載體固定化比載體固定化具有許多重要優(yōu)勢，例如，通過消除固定媒體來降低生產(chǎn)成本；固定簡單，降低細(xì)菌感染風(fēng)險；絮凝顆粒結(jié)構(gòu)松散，無代謝抑制或轉(zhuǎn)運限制。酵母保持高代謝活性；絮凝顆粒中細(xì)菌與絮凝顆粒之間存在動態(tài)平衡，穩(wěn)定絮凝性能。因此，在釀酒中使用絮凝酵母有著悠久的歷史。但是，酵母冷凝的深層機(jī)理尚未確定，酵母冷凝與許多因素有關(guān)，在復(fù)雜的環(huán)境中，酵母極大地影響絮凝的發(fā)酵和發(fā)酵時間。直接決定發(fā)酵效果。因此，有必要進(jìn)一步研究酵母的絮凝機(jī)理，達(dá)到調(diào)節(jié)其絮凝特性的水平；此外，基因工程技術(shù)可用于制造適合工業(yè)生產(chǎn)的工程測量儀器。

二、固定化對酵母的影響

自從酵母細(xì)胞發(fā)展初期，不同研究顯示某些酵母細(xì)胞和酵素細(xì)胞的生物特征及代謝活動有很大的差異。同時，穩(wěn)定酵母與自由酵母的生理生化特性不同，使其在極端環(huán)境下具有不同的應(yīng)激能力。

1.生理代謝狀態(tài)。固定化酵母可以對酵母的形狀、細(xì)胞內(nèi)滲透性、pH 值、細(xì)胞膜滲透性等產(chǎn)生許多影響，破壞酵母原有的生物和生化平衡，導(dǎo)致臨界酶活性的波動、相容溶液的出現(xiàn)和細(xì)胞周期的變化。結(jié)果表明固定酵母細(xì)胞含有較多多糖。同時，細(xì)胞中DNA、RNA 和蛋白質(zhì)的種類和濃度差異很大。人們認(rèn)為這是由于固定對酵母正常細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明，固定酵母生產(chǎn)乙醇的速度比自由酵母快，磷酸鹽基激酶活性和ATP 基酶活性均較高。自絮凝酵母細(xì)胞膜飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比值高于游離酵母，前者的酶活性高于游離酵母。

2.抗脅迫能力。固定化酵母生物和生化特性的變化不可避免地導(dǎo)致其適應(yīng)環(huán)境的變化。混合自絮凝酵母菌層及其親本菌株被置于乙醇溶液中相同濃度進(jìn)行沖擊試驗。結(jié)果表明，自絮凝提升層的融合更能抵抗乙醇脅迫。與此同時，研究表明，固定可以提高凸輪在低溫和高滲透性下的抗壓性。穩(wěn)定酵母之所以更能適應(yīng)艱苦環(huán)境，是因為固定培養(yǎng)環(huán)境的微內(nèi)部環(huán)境產(chǎn)生的高滲透性壓力在酵母細(xì)胞（甘油）的溶解度中起著重要作用。結(jié)果表明，絮凝酵母在乙醇發(fā)酵初期，海藻糖含量、ATP 質(zhì)量膜酶活性和細(xì)胞膜滲透性發(fā)生了顯著變化。固定凸輪也可能導(dǎo)致這些變化，從而提高其強(qiáng)度。

三、發(fā)酵工藝

在燃料乙醇的研究和生產(chǎn)中，發(fā)酵過程逐漸從傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)變?yōu)檫B續(xù)發(fā)酵，酵母的固定化技術(shù)可以大大提高燃料乙醇生產(chǎn)過程中連續(xù)發(fā)酵儲存的效率，使連續(xù)發(fā)酵的細(xì)胞固定化相結(jié)合。

1.反應(yīng)器流化床。具有操作連續(xù)、細(xì)菌污染風(fēng)險低、剪切速率低、傳熱效果好等優(yōu)點。但是，這些反應(yīng)器需要固定化的基本密度和低密度的酵母，這可能導(dǎo)致能源消耗增加、酵母周期改變、分布不均甚至洗出。

2.氣升式反應(yīng)器。具有以下優(yōu)點：抗菌強(qiáng)度高、流動性均勻、結(jié)構(gòu)簡單、衛(wèi)生死角少、功耗低。當(dāng)用氣升式反應(yīng)器處理燃料乙醇中的酶時，固定化的密度應(yīng)接近發(fā)酵通量的密度。應(yīng)當(dāng)指出，發(fā)酵顆粒與其他穩(wěn)態(tài)營養(yǎng)物質(zhì)相比密度較低，機(jī)械強(qiáng)度較低，形狀不規(guī)則，因此只能用于軟酵母中的懸浮發(fā)酵。為此，氣升式反應(yīng)器特別適用于利用自絮凝酵母生產(chǎn)乙醇。在小型實驗室和大型工廠，利用磷酸鹽酵母在多級串聯(lián)反應(yīng)器中繼續(xù)發(fā)酵酶。

3.填充床反應(yīng)器。可提供低返混、簡單結(jié)構(gòu)和載體機(jī)磨損等優(yōu)點。但是，其缺陷，例如不可更換的固體催化劑容易導(dǎo)致風(fēng)管或風(fēng)管，傳熱效果差。此外，填充床反應(yīng)器中使用的固定化介質(zhì)不可壓縮。

4.攪拌反應(yīng)器配備攪拌裝置，質(zhì)量和傳熱性能較好。但是，攪拌可能會產(chǎn)生很大的剪切力，因此在固定構(gòu)造環(huán)境中需要一定的機(jī)械力，否則在固定構(gòu)造環(huán)境中可能會產(chǎn)生機(jī)械磨損，從而導(dǎo)致酵母泄漏。

固體酵母制備乙醇有許多優(yōu)點，前景廣闊。但是，固定化介質(zhì)的選擇、技術(shù)建設(shè)的擴(kuò)大和生產(chǎn)成本的提高限制了固定酵母技術(shù)在乙醇生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。今后的任務(wù)包括：利用基因工程方法建造能提高吸力和發(fā)酵性能的動力裝置；開發(fā)新的、低成本的、固定化介質(zhì)；修改現(xiàn)有的固定化介質(zhì)；改進(jìn)現(xiàn)有的或開發(fā)新的固定化介質(zhì)；分子生物技術(shù)通常用于研究酵母在絮凝機(jī)理的作用，可以構(gòu)建或篩選具有發(fā)酵特性的絮凝酵母菌層，并將其作為載體。因此，我們研究酵母的生物化學(xué)特性，這些酵母在發(fā)酵過程中是穩(wěn)定的，轉(zhuǎn)移、熱力、反應(yīng)器內(nèi)流體特性，基于此，我們試圖優(yōu)化生物反應(yīng)器的設(shè)計，使其在基質(zhì)的發(fā)酵和產(chǎn)物中接合。固定技術(shù)深入酵母上的研究，該技術(shù)將逐步進(jìn)入燃料型乙醇工業(yè)生產(chǎn)，促進(jìn)燃料型乙醇工業(yè)的迅速發(fā)展。