煙草抗青枯病突變體153-K的抗性遺傳及與農藝性狀的關系

牛文利 巫升鑫 余文 程崖芝 楊興有 余祥文 陳志華 劉勇 丁安明 孫玉合 王衛鋒

摘要：煙草青枯病是一種細菌性病害，嚴重影響煙葉生產，篩選抗青枯病的煙草種質并解析其抗性遺傳效應對指導抗病育種具有重要意義。本研究選用感病品種翠碧一號（CB-1）和抗青枯病突變體153-K為親本，構建了F2群體，利用“主基因+多基因”混合遺傳模型分析方法，研究其在安徽、福建兩個病圃環境下的遺傳效應，并對153-K青枯病抗性與農藝性狀進行相關分析。結果表明，153-K在安徽病圃中的最優遺傳模型為MX2-EEAD-AD，即2對等顯性主基因+加性-顯性多基因模型;153-K在福建病圃中最優遺傳模型為MX2-AD-AD，即2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因模型。相關分析結果表明，在安徽、福建兩個病圃環境下，青枯病抗性與株高呈顯著負相關;而與葉片數、節距、莖圍相關性均不顯著。

關鍵詞：煙草;青枯病;抗性突變體;遺傳分析;相關分析

煙草青枯?。═obacco wilt disease）是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土傳細菌性維管朿病害，該病害易感染、傳播快、毀滅性強。煙草青枯病一般在煙草生長后期發生，發病后煙葉產量顯著降低，烤后煙葉青雜煙、光滑煙較多，化學成分不協調，嚴重影響煙草的品質，可用性明顯下降。截至目前，青枯病已成為熱帶、亞熱帶地區煙田的主要病害。在我國，以云南、福建、廣東四川、貴州等南方煙區發病較為嚴重，某些年份甚至造成毀滅性損失，如：云南文山、臨滄和保山等地。近年來，青枯病正在逐漸向北方煙區蔓延在山東、河南、遼寧等煙區均已報道。

青枯病的防治主要有農業、化學和生物防治等措施，但均不能有效預防青枯病的發生與蔓延，且各種防治措施都存在不足及局限性，比如在生產中大量使用農藥對環境造成嚴重破壞等。因此明確煙草青枯病抗性的遺傳規律，選育抗青枯病品種，是目前青枯病防治最基本、最有效、最經濟的防治措施。

選育抗病品種，首先要有良好的抗源并分析其遺傳規律。目前青枯病抗源來源十分狹窄，國內煙草青枯病的抗源主要是從普通煙草品種T448A選育而來，由其育成的DB101及其衍生的Coker139NC95和Coker319是抗青枯病育種的主體親本。

本研究前期通過EMS技術誘變翠碧一號（CB-1）獲得抗青枯病突變體材料153-K，將該突變體在溫室和田間病圃進行青枯病鑒定，153-K均表現為高抗。因此，本研究利用153-K構建CB-1x153-K組合，并通過P1、P2、FI和F2多世代聯合分析，探究153-K抗性基因的遺傳規律，以期為培育優質的抗青枯病新品種提供理論基礎，提高育種效率。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料：抗青枯病突變體153-K由中國農業科學院煙草研究所生物技術研究中心利用EMS誘變CB-1獲得。以CB-1為父本，突變體153-K為母本，雜交獲得F代，F1自交獲得F2群體。

1.2試驗設計

試驗于2020年在安徽省宣城市寒亭鎮和福建省福州市宦溪鎮兩個病圃進行。田間種植行距1.2m，株距0.5m。P，P2，F隨機區組設計，重復3次，每重復10株。安徽F2群體調查205株，福建F2群體調查165株。

1.3農藝性狀調查

按照煙草病蟲害分級及行業標準規定的調查方法（YCT39-1996），以株為單位調查發病情況，并計算病情指數。

參照標準YC/T142-2010《煙草農藝性狀調查測量方法》和文獻[11]中所列方法對F2群體進行主要農藝性狀調査，調查性狀為株高、莖圍、節距、葉片數。

1.4數據分析

采用Microsoft Excel和SPSS20.0軟件進行數據處理、統計分析與相關分析。采用卡方檢驗和植物數量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型分析方法進行遺傳分析。

2結果

2.1153-K抗病性遺傳規律分析

2.1.1病圃青枯病發病情況安徽P（CB-1）的病情指數為8333，P2（153-K）的病情指數為222;福建P1（CB-1）的病情指數為84.79，P2（153-K）的病情指數為31.58。在安徽、福建兩個病圃環境下P（CB-1）對青枯病均表現為高感，突變體P2（153-K）對青枯病均表現為高抗。安徽F（CB-1x153-K）病情指數為90.65。福建F（CB-1×153-K）的病情指數為90.64，且沒有完全抗青枯病植株的存在，這表明青枯病抗性為隱性遺傳。通過SPSS20.0軟件對F2代各病級株數進行正態分布分析（卡方檢驗），發現直方圖中頻率分布有明顯的波峰，且偏度約等于0，說明F2代各病級株數呈正態分布;Q-Q圖檢驗看出各病級的頻數基本分布在直線附近，進一步說明F2代各病級株數服從正態分布（圖1、2）。該結果表明兩個環境下的F2代均存在一定性狀分離，可以進行遺傳規律的分析。

2.1.2主基因+多基因混合模型遺傳規律分析利用P1、P2、F1和F2四個世代，對安徽、福建兩個環境下的煙草抗青枯病突變體153-K的抗青枯病數量性狀進行“主基因+多基因”混合遺傳分析，得到兩個環境下的24種模型的AIC值、極大似然值（表1），根據AIC值最小原則選擇最優模型。在安徽CB-1153-K組合中，AIC值較低的有MX2-EEAD-AD、MX2-A-AD、MX2-AD-AD和2MG-EEAD;在福建CB-1x153-K組合中，AIC值較小的模型有MX2-ADI-AD和MX2-AD-ADI，將以上模型作為兩個環境下的備選模型。

利用、2、る、n、Dm對安徽、福建兩個環境下的備選模型進行適合性檢驗，統計量達到顯著水平個數最少及AIC值最小的模型為最優模型。統計結果顯示（表2），安徽CB-1×153-K組合中，MX2-EEAD-AD、MX2-A-AD、MX2-AD-AD和2MG-EAD分別有5、7、7、7個統計量與該模型的差異達到顯著水平（p《0.05），根據AIC值最小且統計量差異達到顯著水平最少原則，確定MX2-EEAD-AD模型為安徽CB-1×153-K組合的最優遺傳模型，即2對等顯性主基因模型;同理，在福建病圃CB-1×153-K組合中（表3），MX2-ADI-AD和MX2-ADI-ADI分別有8、8個統計量與該模型的差異達到顯著水平（p《0.05），根據AIC值最小原則確定MX2-ADI-AD為福建CB-1×153-K組合的最優遺傳模型，即2對加性-顯性-上位性主基因模型。

2.13遺傳參數估計對安徽、福建兩個環境下最適模型的遺傳參數進行估計。結果表明（表4），在安徽，群體平均數（m）為3.9687，第1對基因的加性效應（da）為1.6121，顯性效應為0。第2對基因的加性效應和顯性效應均為0，說明兩對基因只存在加性效應。此外，ja=ja==0，說明兩對主基因不存在相互作用。多基因的加性效應（の）為0.409，顯性效應（）為1.1795，以顯性效應為主主基因的遺傳率為71.81%。

在福建，CB-1153-K中（表4），群體平均數m）為3.4263，第1對基因的加性效應（da）為2.4959，顯性效應（ha）為-15203，則d》ba且.顯性度（d）小于1，說明第1對基因主要表現為加性作用。在第2對基因中，加性效應值（b）為0.4969，顯性效應值（h）為-1.6512，則第2對基因主要表現為顯性效應。對兩對基因相互作用的參數值進行分析，加性×加性互作效應（）為0.5268，加性顯性互作效應（ia）為1.6213，顯性x加性互作效應（ia）為2.4962，顯性顯性互作效應（）為1.6746，上位性效應均為正向，其中ia》トia》i，表明上位性效應中以顯性ⅹ加性互作和顯性ⅹ顯性互作效應較大，說明其促進了抗病性提高。主基因的遺傳率為94.74%，表明抗性主要受主基因作用，可在后代中穩定遺傳。

2.2153-K抗病性與農藝性狀的相關性分析

2.2.1農藝性狀對2020年安徽和福建田間農藝性狀進行調查分析。從圖3可以看出，CB-1株高顯著高于153-K（p0.05）（圖3A），葉片數與153-K接近，不存在顯著性差異（圖3B）（p》0.05），莖圍顯著粗于153-K（圖3C）（《0.05）;CB-1節距在安徽顯著高于153-K，而兩個品種在福建沒有顯著性差異（圖3D）（p》0.05）。因此，突變體153-K與CB-1相比，153-K的單株表型為整體較矮小，而葉片數無顯著性變化。

2.2.2F2群體的病情級別與農藝性狀的相關分析對F2的病情級別（病級）與田間主要農藝性狀進行相關分析，結果表明（表5），在安徽，病級與株高的相關系數是-0.475（p《0.01），為極顯著負相關，與葉片數、節距、莖圍為不顯著負相關。在福建，病級與株高的相關系數是-0.221（p《0.05），為顯著負相關，病級與葉片數、節距為不顯著負相關，與莖圍為不顯著正相關。

3討論

抗源材料是煙草抗青病育種的基礎，T448A是國內外少數抗青枯病的種質資源之一。1945年美國首個育成抗青枯病品種Oxford26，后來相繼培育出了DB101、Coker139。用Coker139育成的NC95、Coker319和G-28是20世紀70年代美國主要抗青枯病品種和主體親本。而我國青病抗病育種研究起步較晚，開始于20世紀90年代。我國新審定的抗青枯病新品種有云煙、云煙2031、云煙87、巖煙97等。目前國內大部分青枯病抗性來源難以追蹤，抗性來源明確的親本也不屬于常見的抗源。

改進傳統的育種手段和方法，對快速培育煙草抗青枯病優良品種非常重要。EMS誘變技術是人為獲得某些可遺傳新材料的常用方法。中國農業科學院煙草研究所采用EMS處理“翠碧一號”種子，經過M2、M3代抗病性鑒定，獲得“翠碧一號”抗青枯病突變體22個。突變體153-K就是通過EMS誘變技術獲得的高抗青枯病的新抗源，為煙草抗青枯病育種及抗病機理的研究提供了材料。

煙草青枯病抗性是受遺傳和環境兩個相互作用因素的影響。前人研究表明，不同煙草種質資源對青枯病的抗性遺傳存在差異。楊友才等對煙草抗性資源448A的抗性遺傳機理進行研究，結果表明其抗性受顯性單基因控制。QIAN等叫研究認為，巖煙97的青枯病抗性在田間表現為主基因控制。耿銳梅等對巖煙97的青枯病抗性進行分析，結果表明其抗性受2對加性、顯性、上位性主基因以及加性、顯性、上位性多基因控制。鄒文莉等對烤煙品種翠碧一號通過EMS誘變而來的突變體117-K、486-K的抗性遺傳規律進行分析，發現其抗性遺傳效應存在一些差異，突變體117-K的抗性受2對主基因控制，具有加性效應。突變體486-K的抗性受2對主基因控制，具有加性-顯性-上位性效應。

本研究對安徽、福建環境中突變體153-KxCB-1組合P1、P2、F1和F2四個世代采用“主基因+多基因”混合遺傳模型進行聯合分析，在安徽，153-K表現為2對主基因控制，具有等顯性效應。在福建，受2對加性-顯性上位主基因控制，與鄒文莉等24對突變體486-K進行的青枯病抗性遺傳規律研究結果一致。本研究在安徽、福建兩個環境下，其抗性遺傳效應存在一些差異，可能是因為：（1）不同環境下病情的分化差異很大。青枯病多發生在高溫高濕條件下，土壤、氣候等生態條件也會影響青枯病的發生。因此，同一品種在同一年份不同試驗點的發病情況可能也有差異。（2）煙草青枯菌菌系分化比較復雜，因寄主范圍、地理分布、致病性以及生理特性的多樣性和復雜性被公認為多變的復合種青枯菌還具有種下遺傳多樣性。福建、安徽兩個試驗點的青枯菌都是青枯菌生理小種1號，以演化型進行劃分時都是演化型1，但其演化型下具有序列變種差異性。福建省擁有13、14、15、17、34和44六個序列變種，安徽青枯菌為序列變種15，安徽、福建兩個試驗點青枯菌在序列變種上具有差異性。不同試驗點的青枯菌在致病性和某些性狀上可能也存在差異。這可能是153-K遺傳模型不同的原因。總之，雖然兩個試驗點遺傳模型略有不同，但153-K青枯病抗性都是受兩對主基因控制，且均具有顯性效應。

4結論

本研究采用卡方檢驗和“主基因+多基因”混合遺傳模型聯合分析了煙草抗青枯病突變體153-K在安徽、福建兩地試驗點的遺傳規律，分別為MX2-EEAD-AD和MX2-ADI-AD模型。在安徽試驗點，突變體153-K的抗性受2對主基因控制，具有等顯性效應。在福建試驗點中，突變體153-K的抗性受2對主基因控制，具有加性-顯性-上位性效應。對安徽和福建兩個試驗點CB-1×153-KF2群體的病級與農藝性狀進行相關性分析，結果表明，F2病級與株高顯著負相關。葉片數、節距、莖圍對青枯病發病程度影響不顯著。

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