添加殘次蘋果發酵物對稻草青貯品質及其微生物數量的影響

艾 琪 ，蔣 慧 ※，郭 睿 ，蔣 濤 ，蘇華維

（1.塔里木大學動物科學學院，阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，阿拉爾 843300；3.中國農業大學動物科技學院，北京 100193；4.動物營養學國家重點實驗室，北京 100193）

0 引 言

2017年國蘋果栽培面積為 250.96 萬 hm2，比 2016年增加1.73%，總產量達到4 548.40萬t，比2016年增長3.65%[1]。傷殘爛果率一般為 18%～20%，殘次蘋果加工利用率不到 20%[2]。蘋果產業作為新疆林果業的支柱產業，在新疆經濟快速發展過程中發揮著重要作用。2018年，僅南疆阿克蘇地區蘋果產量就達到了50～60萬t[3]。新疆南疆作為偏遠地區，因為缺少深加工、運輸成本較高、產業鏈短的現象，嚴重制約著新疆蘋果產業的優化升級，導致殘爛果率高于全國平均水平，而殘次蘋果加工利用率低于全國平均水平，絕大多數殘次蘋果被拋棄，腐敗變質，污染環境，資源浪費相當之大。將殘次蘋果制作成發酵物，能保存其營養價值以便進一步利用。目前，有關殘次蘋果發酵物作為反芻動物飼料加工利用方面鮮見報道，大多都是研究蘋果渣在反芻動物飼料加工方面的利用[4-6]。

據統計，2015年中國農作物秸稈可收集資源量高達9億t，稻草可收集量約為1.97 t，其中7.80%的秸稈被直接焚燒，還有19.9%未利用[7-8]。據2018年《新疆統計年鑒》顯示，新疆有稻草93.50萬t。稻草中含有豐富的粗纖維類碳水化合物，可作為反芻動物重要的粗飼料來源，但稻草營養價值低、適口性差，單純飼喂很難滿足動物的營養需要，其采食量和飼料轉化率也很低[9]。近年來有研究發現稻草青貯發酵有助于改善稻草品質，但由于稻草附生乳酸菌較少、可溶性碳水化合物含量低等原因，單一青貯很難獲得成功[10]。陳功軒等[11]研究發現飼用苧麻與稻草進行混合青貯之后改善了青貯品質，較好地保持原料的營養特性；全林發等[12]將菠蘿皮和稻草混貯，發現添加菠蘿皮能夠降低混貯的pH值和NH3-N含量，增加了青貯飼料的乳酸含量，添加 20%以上的菠蘿皮時效果更佳；Li等[13]添加紅薯藤來改善稻草青貯品質，降低了青貯的pH值和NH3-N/TN，提高了青貯的乳酸和乙酸含量；He等[14]將辣木葉和稻草混合青貯，改善了混貯的發酵品質，提高了有氧穩定性。本文將殘次蘋果發酵物添加在稻草中青貯，可克服稻草可溶性糖含量低的缺陷，希望為青貯發酵提供更充足的發酵底物，獲得優良的發酵品質，有利于充分利用新疆本地的農副產品資源。

鑒于以上所述，本研究將不同比例殘次蘋果發酵物添加于稻草中進行青貯，旨在探索添加殘次蘋果發酵物改善稻草的青貯品質及其適宜的添加比例，為殘次蘋果發酵物和稻草的初步利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

殘次蘋果發酵物是在市場上購買的殘次蘋果添加本研究團隊篩選的幾種乳酸菌組合經厭氧發酵而得發酵產物[15]，稻草購買于周邊團場。青貯原料的營養成分和微生物數量見表1。

表1 原料營養成分和微生物數量Table1 Nutrient composition and number of microorganisms of raw materials

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，將殘次蘋果發酵物與稻草按不同質量百分比混合，比例分別為Ⅰ全部為稻草、Ⅱ（1∶9）、Ⅲ（3∶7）、Ⅳ（5∶5）、Ⅴ（7∶3）、Ⅵ（9∶1）共6個處理，每個處理3個重復。

1.3 青貯飼料的調制

將稻草切成2～3 cm 左右的長度，殘次蘋果發酵物和稻草按試驗設計的質量百分比混勻，含水率低的組用自來水調節含水率至 70%左右（以便壓實），直接壓入潔凈的 1 L 玻璃廣口瓶中，每組裝填濃度分別為Ⅰ：651 g/L、Ⅱ：662 g/L、Ⅲ：698 g/L、Ⅳ：726 g/L、Ⅴ：755 g/L、Ⅵ：788 g/L，蓋上蓋子后用凡士林和膠帶密封，室溫下保存。青貯制作時對不同比例混合的原料分別進行取樣，用于化學成分分析；90 d 后開蓋取樣，分析青貯飼料營養成分和發酵品質；同時檢測發酵罐開蓋后第0、1、3、7、15、30天各處理有氧暴露下 pH值和微生物的數量。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 青貯原料與青貯飼料營養成分的測定

分別稱取各混合比例發酵前和發酵后各 500 g 在烘箱中65 ℃ 烘干至恒質量，粉碎后過1 mm篩密封保存備用。干物質（Dry Matter，DM）用 105 ℃ 烘干法測定（DHG-9240A，上海齊欣），粗蛋白質（Crude Protein，CP）采用凱氏定氮法測定，中性洗滌纖維（Neutral Detergent Fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid Detergent Fiber，ADF）含量用范氏洗滌纖維法測定[16]；可溶性碳水化合物（Water Soluble Carbohydrate，WSC）用蒽酮-硫酸比色法測定[17]。

1.4.2 青貯飼料的感官評定、pH值及發酵品質的測定

青貯90 d后，參考續元申等方法進行感官評定[18]。開瓶取出青貯飼料后，在自封袋中混合均勻，準確稱取50 g青貯飼料放入1 L 三角瓶中，加2 ℃ 蒸餾水450 mL，用封口膜封口，放入4 ℃ 冰箱中浸提24 h，其間搖晃3～5 次，用滌綸布過濾，并擠盡殘渣中的提取液，用定量濾紙過濾，所得提取液保存備用。在提取液中加入 25%的偏磷酸（浸提液與偏磷酸的體積比為 5∶1），靜置30 min，在1 500 r/min，4 ℃ 狀態下離心15 min，上清液經 0.45μm 濾膜過濾，用高效氣相色譜儀測定乳酸、乙酸等含量[19]。pH值用酸度計（PHSJ-5，上海雷磁）測定。氨態氮（NH3-N）用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[20]。

青貯品質的綜合評分：將有機酸占總酸比例的得分和氨態氮占總氮的得分相結合，兩者各占50 %，即綜合得分=（乳酸得分＋乙酸得分＋丁酸得分）/2＋氨態氮得分[18]。

1.4.3 青貯飼料有氧暴露下微生物數量的測定

青貯90 d 后，青貯飼料開蓋后各處理分別在第0、1、3、7、15、30天稱取20 g樣品，加入180 mL的滅菌水，并做倍比稀釋，每個稀釋梯度做 3個重復，采用稀釋平板涂布法對微生物菌落進行計數[21]。乳酸菌、霉菌、酵母菌分別用MRS培養基、高鹽察氏培養基、麥芽糖浸粉瓊脂培養基進行培養。

1.5 數據處理

試驗數據采用分析軟件DPS v3.01專業版和Excel處理，做單因素方差分析，并做Duncan氏法多重比較。

2 結果與分析

2.1 青貯飼料的感官評定

青貯90 d后，通過觀察殘次蘋果發酵物與稻草混貯的色澤、氣味、質地等對其進行評分并將各處理的評價結果如圖1和表2。處理Ⅰ顏色為黑褐色、有明顯的發霉腐爛、質地發黏結塊，pH值是 5.03，青貯感官得分20，等級為劣；處理Ⅱ的pH值是4.45，顏色為淺褐色、有淡酸味、質地松軟不黏手，青貯感官得分為50，等級為中；處理Ⅲ和處理Ⅳ的 pH值是 4.07、4.01，顏色為亮黃色、甘酸味舒適、質地松軟不黏手，青貯感官得分分別是78、80，等級都是優；處理Ⅴ和處理Ⅵ的pH值分別為 3.94、3.43、顏色呈淺褐色和褐黃色、甘酸味舒適、質地松軟但黏手，青貯感官得分分別是65、56，等級都是良。

圖1 發酵90 d后的殘次蘋果發酵物和稻草混合青貯外觀Fig.1 The appearance of mixed silage with defective apple and rice straw after 90 days fermentation

2.2 混合青貯發酵前、后的營養成分

由表3可知，各混合青貯比例發酵前，處理Ⅰ和處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的DM含量顯著高于處理Ⅴ、Ⅵ（P＜0.05）。發酵后，處理Ⅰ和處理Ⅲ、Ⅳ的 DM 含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于處理Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ（P＜0.05）；混合青貯發酵前和發酵后CP含量均隨著殘次蘋果發酵物在青貯中的比例增加而增加，處理Ⅰ的CP含量顯著低于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ這4個處理（P＜0.05）；發酵前和發酵后處理Ⅰ的 NDF、ADF的含量均顯著高于其他5個處理（P＜0.05），其他各處理中隨著殘次蘋果發酵物的增加 NDF、ADF的含量逐漸降低；發酵前 WSC含量隨著殘次蘋果發酵物的增加逐漸增加，且各處理之間差異顯著（P＜0.05）。發酵后處理Ⅰ的WSC含量顯著低于其他各處理Ⅵ（P＜0.05），處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 混合青貯飼料感官評分Table 2 The sensory evaluation of mixed silage

表3 稻草發酵前、后的營養品質Table 3 Nutritional quality of rice straw before or after fermentation %

2.3 混合青貯飼料的發酵品質及綜合評價

不同比例殘次蘋果發酵物與稻草混合青貯發酵品質及綜合評價如表4所示。處理Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的乳酸含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（P＜0.05）；乙酸含量隨著殘次蘋果發酵物在青貯中的比例增加而增加，處理Ⅰ的AA含量顯著低于其他各處理組（P＜0.05）；處理Ⅱ和處理Ⅵ的丙酸含量均為微量，處理Ⅴ丙酸含量最高；處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ之間的丁酸含量差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于處理Ⅰ和處理Ⅵ（P＜0.05）；處理Ⅰ的 NH3-N/TN的比值顯著高于其他 5個處理（P＜0.05）。

由綜合評價可知，處理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的LA/TA比值均高于50%，處理Ⅰ和處理Ⅱ的LA/TA比值分別為22.37%、30.38%；AA/TA的比值隨著殘次蘋果發酵物的增多而升高，處理Ⅵ的AA/TA的比值最高（36.10%）；處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的BA/TA比值均低于4%，處理Ⅰ的BA/TA比值最高（28.95%）；各處理綜合得分分別為37.5、76.0、94.5、95.0、90.5、85.0，處理Ⅳ的得分最高。

2.4 有氧暴露后pH值和微生物數量的變化

pH值的變化如圖2所示。有氧暴露期間，處理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的pH值上升緩慢，且差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ（P＜0.05）；并且隨著有氧暴露時間的延長，各處理的 pH值逐漸升高，在有氧暴露第30 天時各處理的pH值均達到最高。

乳酸菌的數量隨著有氧暴露時間的延長而減少；在有氧暴露的0～30 d內，處理Ⅰ的乳酸菌數量均顯著低于其他5個處理（P＜0.05）；處理Ⅰ和處理Ⅵ的乳酸菌數量減少的幅度較大。到有氧暴露第 30 天 時處理Ⅰ的乳酸菌數量顯著低于其他5個處理（P＜0.05），處理Ⅳ的乳酸菌數量最多。

酵母菌數量變化隨著有氧暴露時間的延長而增多，處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的酵母菌數量增多的幅度較大；在有氧暴露第0～7天，處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ酵母菌的數量迅速增長，以后增長緩慢，處理Ⅳ的酵母菌數量增加緩慢，并顯著低于其他處理（P＜0.05）；當有氧暴露 30 d時，處理Ⅰ的酵母菌數量仍顯著高于其他各處理（P＜0.05），處理Ⅵ的酵母菌數量最少。

霉菌數量隨著有氧暴露時間的延長逐漸增多，處理Ⅰ和Ⅵ的霉菌數量顯著高于其他處理（P＜0.05）；處理Ⅲ、Ⅳ的霉菌數量最低，顯著低于其他幾個處理（P＜0.05）。

圖2 有氧暴露過程中混合青貯pH值和微生物數量的變化Fig.2 Changes of pH value and microbial quantity in mixed silage during oxygen exposure

3 討 論

3.1 添加比例對感官品質的影響

感官評價是通過青貯的色澤、質地、氣味等來進行初步評價青貯是否成功[22]。優質青貯飼料顏色應與青貯原料顏色相近，氣味酸醇有芳香，質地柔軟稍濕潤，且無霉變發生[23]。本試驗結果發現，稻草單一青貯90 d后，有明顯腐爛且有霉味，說明稻草單獨青貯不成功。而添加了殘次蘋果發酵物的處理Ⅱ～Ⅳ青貯90 d后，由淡酸味變為甘酸味，顏色由褐黃色變為亮黃色；在質地方面，松散柔軟不黏手，說明添加殘次蘋果發酵物可以改善稻草青貯的感官品質。處理Ⅴ和處理Ⅵ顏色較深，發黏結塊，這可能是由于加入殘次蘋果發酵物比例較高使得青貯水分含量過高造成的。感官評分中顯示添加殘次蘋果發酵物與稻草的比例在3:7～5:5之間感官評分最高。

3.2 添加比例對稻草青貯營養成分的影響

青貯是否成功主要受原料糖分含量、水分及壓實程度的影響[24]。本研究中稻草的水分少、WSC含量低，單獨青貯品質差；而單一的殘次蘋果發酵物水分高達92.12%，WSC的含量達到了15.56%，能夠彌補稻草青貯水分少、WSC含量低的不足。本試驗中，隨著稻草青貯中添加殘次蘋果發酵物比例的增加，青貯原料的 CP和WSC含量增加，為青貯微生物發酵提供了豐富的底物，是添加殘次蘋果發酵物改善稻草青貯品質的原因之一。這與羅穎潔等[25]通過添加麥麩增加青貯原料中的 CP和WSC含量改善稻秸與苜蓿混貯品質；李君臨等[26]添加多花黑麥草增加稻草混貯中的CP和WSC改善二者的混貯品質的效果一致。

3.3 添加比例對稻草青貯發酵品質的影響

pH 值是青貯飼料是否發酵成功的重要指標之一，品質優良的青貯飼料pH值應在3.8～4.2之間，發酵時pH值越低，青貯飼料越容易保存[27]。pH值低于4.6時，蛋白質較穩定，只有少部分被分解；pH值高于4.6時，腐敗菌、梭菌等雜菌的含量增多青貯飼料的蛋白質進一步被分解，營養成分損失較多[28]。有研究報道，青貯飼料低pH值能夠抑制蛋白酶的活性，減少蛋白質的降解，而且還可以抑制對青貯有害的細菌生長，保障青貯品質[29]。由本試驗結果可知，單一稻草青貯的pH值是5.03，隨著殘次蘋果發酵物的增多混貯飼料的pH值在逐漸降低，最低為 3.43，說明添加殘次蘋果發酵物能降低混合青貯飼料的pH值，抑制有害微生物的繁殖。

有研究表明，青貯飼料在乳酸菌作用下，發酵飼料中的營養物質生成大量有機酸，使青貯飼料的 pH值降低，抑制有害微生物，使乳酸菌成為青貯的優勢菌群[30]。在青貯飼料中乳酸含量越高，pH值也就越低，青貯以乳酸發酵為主，青貯質量也就越好[31]。孫雨坤等[32]的研究表明，添加蘋果渣可以彌補苜蓿青貯所需的可溶性碳水化合物，降低了pH值，乳酸含量增加并抑制了其他有害微生物的繁殖。本試驗表明，隨著殘次蘋果發酵物添加比例的增多，乳酸和乙酸含量也逐漸增多，而丁酸含量呈減少的趨勢。這就說明添加殘次蘋果發酵物的稻草青貯改善了稻草的發酵品質。雖然處理Ⅴ和處理Ⅵ的乳酸和乙酸含量比其他幾個處理都有都高，但丁酸含量也較高，這有可能是因為處理Ⅴ和處理Ⅵ中水分較多干物質較少導致的。并且綜合評分從低到高的順序為ⅣⅢⅤⅥⅡⅠ，這與感官評價的結果一致。

NH3-N/TN被廣泛用于衡量青貯飼料發酵品質的好壞，其比值越大，說明被分解的蛋白質和氨基酸越多，青貯質量就越差，優質青貯飼料的NH3-N/TN含量應低于10%[33-34]。本試驗中，單一稻草青貯（處理Ⅰ）的處理NH3-N/TN高達 16.28%，說明發酵品質差；其他各處理NH3-N/TN比值均低于10%，達到優良青貯飼料的要求，表明添加殘次蘋果發酵物能降低蛋白質的降解，更好保存飼料營養物質。發酵產物的綜合評分中顯示添加殘次蘋果發酵物與稻草的比例在3:7～5:5之間綜合評分最高。

3.4 添加比例對稻草青貯有氧暴露 pH值和微生物的動態變化

青貯飼料在有氧暴露情況下，好氧性微生物就會利用青貯中的養分進行繁殖，酵母菌和霉菌數量增多，乳酸菌受抑制而數量減少，使得青貯飼料的pH值上升，有氧穩定性差[35]。本試驗中，有氧暴露期間，處理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的pH值上升幅度緩慢，處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的pH值上升幅度較快。表明不添加殘次蘋果發酵物（Ⅰ）、添加過少（Ⅱ）或過多（Ⅵ）青貯飼料有氧穩定性差。

有研究發現，在有氧暴露情況下乳酸菌數量逐漸減少，而酵母菌和霉菌等好氣性微生物因條件適宜而大量繁殖，導致青貯飼料營養損失并腐敗[36-37]。在本試驗中，有氧暴露后處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的乳酸菌數量減少的幅度較大，而酵母菌數量增多的幅度較大，處理Ⅳ的乳酸菌保留最多，處理Ⅰ和Ⅵ的霉菌數量顯著高于其他處理（P＜0.05）；處理Ⅲ、Ⅳ的霉菌數量最低。這表明處理Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的有氧穩定性差，處理Ⅲ、Ⅳ的有氧穩定性較好。各處理的乳酸菌數量均隨著有氧暴露時間的延長而逐漸減少，酵母菌和霉菌的數量隨著時間的延長逐漸增多，這與Spadaro等[38]和王旭哲等[39]的研究有相似的結果。處理Ⅴ和處理Ⅵ的酵母菌和霉菌數量增加幅度較大，這可能是因為殘次蘋果發酵物水分、可溶性碳水化合物含量較高，添加殘次蘋果發酵物比例越高混貯中水分和可溶性碳水化合物含量就越高。在有氧暴露情況下，酵母菌和霉菌等好氣性微生物更易大量繁殖有關，這與周瑞等[40]將甜菜塊根和玉米秸稈混貯的結果一致。

4 結 論

1）添加殘次蘋果發酵物能顯著提高（P＜0.05）單一稻草青貯的可溶性碳水化合物和粗蛋白的含量。

2）添加殘次蘋果發酵物能顯著提高（P＜0.05）稻草青貯的乳酸和乙酸含量，降低 pH值、丁酸含量和NH3-N/TN的比值，改善青貯的感官品質和發酵品質。

3）添加殘次蘋果發酵物與稻草的比例在3:7～5:5之間適宜。