補陽還五湯含藥血清對TGF-β1誘導的人肺動脈內皮細胞Dll4/Notch4信號的調控作用

渠景連 趙惠亮 楊邯捷 郭永勝

（貴州中醫藥大學，貴州貴陽550025）

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的好發于中老年人群的以刺激性干咳和進行性呼吸困難為主要癥狀的慢性、進行性、纖維化性間質性肺疾病，其肺功能提示限制性通氣功能障礙及彌散功能下降，由于缺乏有效的治療方法，很多患者在確診后3至5年內死亡[1-3]。隨著人口老齡化，該病發病率越來越高，嚴重威脅人類健康和生命，因此尋求有效的治療方法是當前面臨的一項極具挑戰性的課題。有研究表明，內皮間質轉化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）是IPF發生發展的重要機制，在這一過程中，包括Dll4/Notch4等在內的Notch信號通路參與了EndMT[4-5]。補陽還五湯是清·王清任《醫林改錯》中補氣活血通絡的經典名方，被廣泛用于IPF的治療，且取得了較好的療效[6-7]。課題組前期研究表明，補陽還五湯能夠通過干預EndMT來防治IPF[8]，我們推測這一過程與調控Dll4/Notch4信號傳導有關。因此，本研究基于血清藥理學方法，觀察補陽還五湯含藥血清對TGF-β1誘導的人肺動脈內皮細胞Dll4/Notch4信號的影響，以期進一步闡明該方防治IPF的作用機制，為臨床防治本病提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 藥物 黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁、西紅花均購自貴陽同仁堂藥房，經貴州中醫藥大學藥學院孫慶文教授鑒定為正品。

1.2 動物 健康8周齡新西蘭兔10只，體重2～2.5 kg，由儀征安立卯生物科技有限公司提供，許可證號SYXK（蘇）2016-0005。

1.3 細胞株 HPAEC細胞，由廣州吉妮歐生物科技有限公司提供，培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，常規傳代培養。

1.4 主要試劑與儀器 TGF-β1（美國Peprotech公 司，批 號041316-1）；RPMI-1640培 養 基，胎牛血清，青霉素/鏈霉素，胰酶（美國Hyclone公司，批 號 分 別 為AC135526825、AC105264991、AC101511834、AC114002159）；DAPT（美國MCE公司，批號11982）；Trizol試劑盒，逆轉錄試劑盒，SYBR?Premix Ex Taq（日本Takara公司，批號分別為AI80403A、RR047A、RR820A）；Notch4抗體、Dll4抗體、CBF1抗體、NICD4抗體（英國abcam公 司，批 號 分 別 為GR288351-4、GR162316-12、GR3180240-6、GR288351-4）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（成都正能生物技術有限責任公司，批號HH0607）；山羊抗兔辣根過氧化酶（HRP）標記二抗、兔抗山羊HRP標記二抗、山羊抗小鼠HRP標記二抗（美國Affinity公司，批號分別為3825j63、34q9532、1292k61）；RIPA蛋 白 裂 解 液，BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為P0013B、P0011）；PVDF膜（美國Millipore公司，批號為R8DA5001）；免疫共沉淀（Co-IP）試劑盒（美國pierce公司，批號SG251012）。

BSC-03IIA2-SE型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；Ts2R型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公 司）；3131型CO2培 養 箱，Multiskan 51119000型酶標儀，NanoDrop 2000紫外分光光度計（美國ThermoFisher公司）；Stepone plus熒光定量PCR儀，Veriti PCR熱循環儀（美國應用生物系統公司）；SDS-PAGE電泳儀，濕法轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；Tanon 5200化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備 結合人和動物體表面積折算的等效劑量表（1.5 kg家兔體表面積為70 kg人的0.07倍），根據人的用藥量（黃芪120 g，當歸6 g，赤芍5 g，地龍3 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g）計算家兔等效劑量，得到補陽還五湯的家兔等效劑量為6.67 g/（kg·d）。結合動物數量及實驗中的損失，估算出所需總藥量，一次煎煮出所需藥液，4 ℃保存備用。健康新西蘭兔適應性喂養3 d后隨機分為補陽還五湯組和空白對照組。補陽還五湯組灌胃給予家兔等效劑量8倍的藥物[53.36 g/（kg·d）]，空白對照組給予等容積生理鹽水，連續給藥3 d。末次給藥1 h后麻醉狀態下頸動脈取血，常溫下分離血清，56 ℃水浴滅活，0.22 μm過濾除菌，-80 ℃保存備用。

2.2 EndMT模型制備 將HPAEC細胞種于六孔板中，待細胞長至80%～90%融合度時，去除完全培養基，加入0.5% FBS的1640培養基同步24 h，使細胞處于同一生長周期，然后加TGF-β1（5 mg/L）刺激細胞72 h后觀察細胞形態變化，當細胞形態由鋪路石樣向梭形轉化，細胞間連接減少，且細胞間隙變大時，提示EndMT發生，細胞模型制備成功。

2.3 分組 實驗分為空白組（10%空白血清）、模型組（10%空白血清+TGF-β1）、DAPT組（10%空白血清+DAPT+TGF-β1）、10%含藥血清組（10%含藥血清+TGF-β1）、5%含藥血清組（5%含藥血清+5%空白血清+TGF-β1）和2.5%含藥血清組（2.5%含藥血清+7.5%空白血清+TGF-β1）。其中TGF-β1濃度均為5 mg/L，DAPT濃度為0.5 μmol/L。

2.4 RT-PCR試驗 細胞經同步化培養24 h后，按上述方法造模、給藥，培養72 h后收集細 胞，用Trizol法 提 取 細 胞 總RNA。Nanodrop檢測濃度，RNA純度根據Nanodrop檢測的濃度和OD230、OD260、OD280決 定。 參 照 逆 轉 錄 試 劑盒說明書進行逆轉錄試驗，引物由通用生物系統（安徽）有限公司設計合成。Notch4上游引物：5'-AGTGGTGTGAGGTGGAGATA-3'，Notch4下 游 引物：5'-GGGCAGTGGCAGATGAAA-3'；Dll4上 游 引物：5'-ACGAATGCATCCCCCACAAT-3'，Dll4下游引物：5'-ACAGGTGCAGGTGTAGCTTC-3'；CBF1上游 引 物：5'-TCATGCCAGTTCACAGCAGT-3'，CBF1下 游 引 物：5'-GGAGTGCCATGCCAGTAACT-3'；GAPDH上 游 引 物：5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCT GGTAA-3'，GAPDH下 游 引 物：5'-GGGTGGAATCA TATTGGAACATGT-3'。PCR反 應 體 系：cDNA模板2 μL，SYBR Green solution 10 μL， 上 游 引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游 引物（10 μmol/L）0.4 μL，無菌雙蒸水7.2 μL，配制成20 μL的反應標準體系。反應條件：酶激活95 ℃，10 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸1 min，采集熒光信息，擴增40個循環；95 ℃，10 s，溶解曲線60～95 ℃，采集Tm值信息，可以通過Tm值是否單一判斷產物是否為特異性擴增。使用軟件分析PCR過程中各檢測樣本的Ct值，通過2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

2.5 Western blot試驗 細胞經同步化培養24 h后，按上述方法造模、給藥，培養72 h后收集細胞，加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑，4 ℃裂解15 min，13 500 g離心15 min，收集上清液，取少量進行蛋白定量，根據所測濃度加入上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min，保存于-20 ℃待用。配制分離膠和濃縮膠，將已加入上樣緩沖液的標準蛋白質樣品及待測樣品加入樣品槽內，100 V恒壓電泳約60 min，當溴酚藍到達分離膠的底部，關閉電源。100 V，60 min，4 ℃轉膜，5%脫脂奶粉室溫輕搖封閉60 min。將一抗用含5% BSA的TBST溶液按照1∶1000稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。將二抗用TBST按照1∶5000稀釋，室溫下孵育2 h，取出PVDF膜，TBST洗膜3次，每次10 min。Tanon凝膠成像系統成像，Image J軟件進行圖片分析。

2.6 免疫共沉淀（Co-IP）試驗 細胞經同步化培養24 h后，按上述方法造模、給藥，培養72 h后收集細胞，提取蛋白樣本，每個試驗樣本體積為500 μL，每個樣本留取30 μL作為試驗input。準備protein A/G beads，每500 μL蛋 白 樣 品 液 加 入500 μL protein A/G beads，4 ℃緩慢垂直旋轉10 min，以去除和bead非特異性結合的蛋白，降低背景，4 ℃、5000 g離心30 s，將上清轉移至一個新的離心管中，去除protein A/G beads。每孔加入5 μg抗體，4 ℃，垂直旋轉混勻緩慢旋轉孵育過夜。加入50 μL的protein A/G beads（含50%濃度）到每個蛋白樣品液中，4 ℃緩慢搖動4～6 h，使beads與抗體進行結合。4 ℃、5000 g離心30 s，收集bead-抗原抗體復合物，棄上清，用預冷的wash buffer洗3次，1 mL/次，每次4 ℃緩慢垂直旋轉15 min。用50 μL的2×上樣緩沖液將bead-抗原抗體復合體重懸，輕輕混勻，100 ℃煮10 min，以分離抗原、抗體和bead，常 溫13 000 g離 心1 min，收 集 上 清，IP和input樣 本 進 行SDS-PAGE電泳。

3 實驗結果

3.1 各組HPAEC細胞Notch4、Dll4和CBF1 mRNA表達比較 見表1。

3.2 各組HPAEC細胞Notch4、Dll4和CBF1蛋白表達比較 見表2，圖1。

3.3 各組HPAEC細胞NICD4與CBF1結合情況比較 由Co-IP結果可知，NICD4和CBF1有結合作用，TGF-β1能促進二者的結合，提示EndMT發生時Dll4/Notch4信號被激活，而阻斷Notch信號通路后NICD4和CBF1結合被抑制，補陽還五湯含藥血清能抑制NICD4和CBF1結合，且隨著補陽還五湯含藥血清濃度增加，NICD4和CBF1結合作用降低。見圖2。

表1 各組HPAEC細胞Notch4、Dll4和CBF1 mRNA表達比較（）

表1 各組HPAEC細胞Notch4、Dll4和CBF1 mRNA表達比較（）

注： 與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 ；與DAPT組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 樣本數 Notch4 mRNA Dll4 mRNA CBF1 mRNA空白組 3 1.000±0.026 1.000±0.036 1.000±0.038模型組 3 1.696±0.090** 1.676±0.036** 2.187±0.039**DAPT組 3 1.032±0.147## 1.167±0.031*## 1.486±0.070**##2.5%含藥血清組 3 1.514±0.004**#△△ 1.266±0.025**#△△ 1.797±0.059**##△△5%含藥血清組 3 1.456±0.048**#△△ 1.401±0.094**##△△ 1.734±0.110**##△10%含藥血清組 3 1.277±0.114##△ 1.192±0.032**## 1.447±0.087**##

表2 各組HPAEC細胞Notch4、Dll4和CBF1蛋白表達比較（）

表2 各組HPAEC細胞Notch4、Dll4和CBF1蛋白表達比較（）

注： 與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 ；與DAPT組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 樣本數 Notch4/GAPDH Dll4/GAPDH CBF1/GAPDH空白組 3 0.196±0.066 0.187±0.022 0.085±0.020模型組 3 0.543±0.081** 0.618±0.075** 0.451±0.017**DAPT組 3 0.097±0.010## 0.285±0.087## 0.245±0.033**##2.5%含藥血清組 3 0.505±0.093**△△ 0.587±0.096**△△ 0.444±0.008**△△5%含藥血清組 3 0.372±0.056**##△△ 0.443±0.057**#△ 0.299±0.034**##△10%含藥血清組 3 0.283±0.057##△△ 0.341±0.091*## 0.205±0.024**##

圖1 各組HPAEC細胞Notch4、Dll4、CBF1蛋白表達

圖2 各組HPAEC細胞NICD4與CBF1結合情況

4 討論

IPF是最常見、最具侵襲性的肺泡疾病，正常的肺泡結構逐漸消失，進而被纖維化組織所取代，其主要特征是成纖維細胞增殖和細胞外基質過度沉積。如前所述，EndMT是肺部發生纖維化的機制之一，即內皮細胞在各種刺激因素的作用下向間質細胞轉化。TGF-β1是調控纖維化EndMT的關鍵細胞因子，可以誘導EndMT的發生，肺血管內皮細胞可以通過EndMT而形成肺成纖維細胞[9]。因此本研究采用TGF-β1誘導HPAEC細胞發生間質轉化建立EndMT細胞模型。

Notch信號通路是在進化上高度保守的單次跨膜信號受體蛋白家族，在哺乳動物體內由Notch受體（Notch1-Notch4）、Notch配體（Dll1、Dll3、Dll4，Jagged 1和Jagged 2）和轉錄因子CBF1/RBP-Jκ組成[10]。Notch配體和特定受體的結合激活Notch信號，Notch蛋白經過γ-secretase剪切釋放其胞內段NICD，此為Notch受體的活性形式，NICD進一步被轉運至細胞核內，與轉錄因子CBF1/RBP-Jκ結合，進而激活下游靶基因的轉錄[11]，使用γ-secretase抑制劑DAPT可抑制Notch信號通路的激活。內皮細胞中激活的Notch信號可導致形態學、表型和功能改變，并誘導EndMT發生[12-13]。Notch4受體作為Notch家族的一員，是血管內皮細胞的特異性受體，Dll4也主要分布于血管內皮細胞，是一種重要的血管生長發育調節因子，通過與鄰近細胞上的Notch1、Notch4等受體結合而啟動細胞內信號傳遞，從而影響細胞增殖、遷移，參與血管重塑[14]。在成人期的血管環境中，Dll4下調了內皮細胞的增殖、分化和遷移能力，阻礙了血管發生[15]。CBF1是Notch4信號通路的下游信號分子，也是重要的轉錄調節因子，參與Dll4/Notch4信號的激活。我們前期研究表明，當大鼠發生肺纖維化時，Dll4/Notch4信號傳導被激活[16]，本研究結果顯示，經TGF-β1誘導后，HPAEC細胞的Notch4、Dll4和CBF1的mRNA和蛋白表達均上調，且Notch4的活性形式NICD4與CBF1有結合作用，說明EndMT發生時Dll4/Notch4信號傳導激活，而使用DAPT干預后可抑制Dll4/Notch4信號傳導激活，Dll4/Notch4信號的激活抑制了內皮細胞的增殖，這可能加劇了間質轉化的發生。

IPF是一種以咳嗽、氣短、乏力等為主癥的難治性疾病，發病多因肺氣虧虛、肺絡瘀滯，在病變發展過程中，二者又相互影響。肺氣虧虛，無力布津行血，則血行緩慢，停留而為瘀，進而阻滯肺絡；肺絡瘀滯，治節無權則氣血津液難以上行養肺，以致肺體失養，氣機不利，甚至瘀久生毒，肺氣受損更為嚴重[8]。總而言之，肺虛絡阻是本病的主要病機，治療當益氣活血通絡。補陽還五湯是益氣活血通絡的經典名方，方中重用補氣藥，并配以少量活血通絡之品，使氣旺血行以治本，瘀消絡通以治標，標本兼顧。本研究結果表明，補陽還五湯含藥血清可抑制TGF-β1誘導的HPAEC細胞的Notch4、Dll4和CBF1的mRNA及蛋白表達，且可以抑制NICD4與CBF1的結合，可見補陽還五湯干預EndMT防治肺纖維化的作用機制與調控Dll4/Notch4信號傳導有關，但其具體靶點和機制還有待后續進一步確認。此外，本研究結果還顯示，2.5%、5%補陽還五湯含藥血清組HPAEC細胞Notch4、Dll4和CBF1 mRNA及蛋白表達均顯著高于DAPT組，而10%含藥血清組除Notch4 mRNA及蛋白表達顯著高于DAPT組外，Dll4和CBF1 mRNA及蛋白表達與DAPT組比較差異無統計學意義，且補陽還五湯含藥血清和DAPT均能抑制NICD4和CBF1結合，隨著補陽還五湯含藥血清濃度增加，NICD4和CBF1結合作用降低。提示10%補陽還五湯含藥血清調控Dll4/Notch4信號傳導干預EndMT的作用與DAPT相當，且補陽還五湯還具有多靶點、多途徑的調控作用，在IPF的防治中顯示出越來越多的優勢。由于本研究只觀察了Dll4/Notch4信號傳導，是否還和其他信號通路存在交叉作用，將是我們下一步研究的方向。