無(wú)花果多糖分離純化工藝及抗氧化性能研究

蔡惠鈿，張逸

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642；2.華農(nóng)(潮州)食品研究院有限公司，廣東 潮州 521000)

無(wú)花果是桑科榕屬開(kāi)花植物，產(chǎn)于地中海沿岸，屬亞熱帶落葉小喬木。近些年來(lái)，由于其廣泛的觀賞、食用價(jià)值，得到了大力培育和利用。

以無(wú)花果為原料的保健品食品不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，而且風(fēng)味更加美味，相關(guān)的工藝技術(shù)研究多有報(bào)道。胡艦等[1]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了無(wú)花果復(fù)配生姜汁嫩化獅子頭的工藝。譚海剛等[2]利用無(wú)花果進(jìn)行果醋釀造，研究了無(wú)花果果醋的最佳釀造工藝。無(wú)花果中包含大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等，可以在分離純化中保留下來(lái)，提高了無(wú)花果的利用效率。從王宇晴等[3]應(yīng)用快速溶劑萃取法提取靈芝多糖的研究中可以看出，多糖分離純化與溫度密切相關(guān)，無(wú)花果作為一種保健型調(diào)味品，其多糖分離純化最佳溫度也是固定的，因其味道淡雅，已經(jīng)得到廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。

目前，國(guó)內(nèi)無(wú)花果多糖分離純化研究大多停留在實(shí)驗(yàn)階段，其以生產(chǎn)工藝優(yōu)化為主，各類產(chǎn)品繁多，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)較少。國(guó)外無(wú)花果多糖分離純化研究主要是酵母菌研究，工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模較小，使用儀器分析方法測(cè)定的抗氧化活性結(jié)果并不具有代表性，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較低。因此，為了豐富無(wú)花果市場(chǎng)，研究無(wú)花果多糖的分離純化工藝及其抗氧化性能，對(duì)指導(dǎo)人們合理飲食，提高人體抗病能力，促進(jìn)人體健康具有重要意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

無(wú)花果：由山東濱州永大三合無(wú)花果開(kāi)發(fā)有限公司提供，品種為紫果，經(jīng)過(guò)壓榨后獲取無(wú)花果殘?jiān)?，?0 ℃條件下烘干無(wú)花果汁，粉碎后使用20目篩選備用。

試劑：濃硫酸，來(lái)自祁縣匯鴻源化工公司；無(wú)水乙醇，來(lái)自濟(jì)南雙盈化工有限公司；石油醚，來(lái)自江蘇省海安石油化工廠；氯仿，來(lái)自魯西化工集團(tuán)股份有限公司；正丁醇，來(lái)自山東諾爾化工有限公司；丙酮，來(lái)自南京建滿化工有限公司；NaCl，來(lái)自無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；NaOH，來(lái)自臨沂多彩化工有限公司；HCl，來(lái)自德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

用水：由東莞市佰純水處理設(shè)備有限公司生產(chǎn)的蒸餾水。

1.2 設(shè)備

高效液相系統(tǒng) 深圳市寶安區(qū)松崗天瑞環(huán)保設(shè)備廠；電子分析天平 河南省泰斯特儀器有限公司；蒸發(fā)儀 鞏義市宇翔儀器有限公司；真空泵 深圳市煒圣鈦電子有限公司；水浴鍋 泰州市誠(chéng)倍教學(xué)設(shè)備有限公司；超濾系統(tǒng) 東莞市綠城水處理設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī) 江西南翔空壓機(jī)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 無(wú)花果多糖提取

從山東濱州永大三合無(wú)花果開(kāi)發(fā)有限公司隨機(jī)選取無(wú)花果，粉碎后得到50 g無(wú)花果渣。對(duì)無(wú)花果的干燥處理步驟如下：

檢查無(wú)花果，盡可能確保無(wú)花果都沒(méi)有傷痕，并且表面無(wú)其他物質(zhì)，并在干燥之前清洗無(wú)花果[4-6]。用木錘或者普通的搟面杖敲擊無(wú)花果，并盡可能保持完整，既不要搗成泥狀或碎成很多塊，也不要破壞它的果核，讓它的果肉裂開(kāi)[7-9]。然后將無(wú)花果浸入冷水中，需要完全淹沒(méi)，確保沒(méi)有露出來(lái)的[10-11]。這時(shí)可以用平底鍋或其他比較重的東西將浮上來(lái)的壓下去，之后使其中的水結(jié)成冰，然后降壓，冰就會(huì)直接升華為水蒸氣，從食品中逸出[12]。

經(jīng)過(guò)干燥處理后，再用石油醚脫脂3次。之后向其中加入500 mL蒸餾水，在100 ℃溫度下萃取3 h，過(guò)濾，再萃取濾渣，合并為濾液[13]。經(jīng)濃縮至1/4的原體積后，需將濃縮后濾液中的蛋白質(zhì)去除。在6次去蛋白后，緩慢加入4倍體積的由濟(jì)南雙盈化工有限公司生產(chǎn)的無(wú)水乙醇進(jìn)行濾液沉淀，離心12 h后在4 ℃溫度下采集沉淀物，由此獲得無(wú)花果粗多糖[14]。

采用分子量為10 kDa的扁平纖維素超濾膜，將無(wú)花果多糖溶于水中進(jìn)行超濾[15]。在60 ℃以下，采集分子量大于10 kDa的部分濃縮成1/4的原體積。慢慢加入無(wú)水乙醇，攪拌，在75%的濃度下，靜置12 h，在3000 r/min的條件下離心，然后用無(wú)水乙醇和丙酮進(jìn)行沉淀，冷凍干燥，由此獲取無(wú)花果多糖。

2.2 無(wú)花果多糖理化性質(zhì)分析

2.2.1 多糖測(cè)定

將100 mg粗多糖樣品準(zhǔn)確稱量，制成10 mL的水溶液。粗多糖的吸光度與粗多糖樣品的吸光度基本一致，其含量按標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算[16]。多糖測(cè)定公式：

(1)

2.2.2 理化性質(zhì)

經(jīng)水提醇沉淀，去蛋白，除去小分子雜質(zhì)，冷凍干燥后得到無(wú)花果多糖。表面呈淡灰色，無(wú)臭，易溶于水， pH值4.2，難溶于甲醇、乙醇、丙酮、醚等有機(jī)溶劑中。

碘-碘化鉀反應(yīng)為陰性，表明經(jīng)水提醇后的無(wú)花果不含淀粉；茚三酮反應(yīng)為陰性，表明產(chǎn)品無(wú)花果中不含有蛋白質(zhì)； UV光譜分析表明無(wú)花果多糖在260，280 nm時(shí)，沒(méi)有特征表示明顯吸收蛋白質(zhì)和核酸；在192 nm時(shí)，有一個(gè)吸收峰，表示糖的特征性吸收峰，見(jiàn)圖1。

圖1 無(wú)花果多糖的紫外光譜Fig.1 UV spectra of fig polysaccharides

無(wú)花果的陽(yáng)性結(jié)果是含糖的，由多糖測(cè)定公式計(jì)算得到無(wú)花果多糖得率，采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量。在濃硫酸條件下，多糖經(jīng)水解轉(zhuǎn)化為單糖脫水。假如無(wú)花果試樣中含有0.1 mol三糖、0.1 mol二糖和0.1 mol單糖，經(jīng)硫酸處理后可轉(zhuǎn)化為0.6 mol脫水單糖。再加入酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)與脫水的單糖形成彩色化合物，利用吸收光度法測(cè)定處理液中單糖含量。由此可知，苯酚-硫酸法實(shí)際測(cè)定的是總糖。

2.3 去除多糖中的色素

試驗(yàn)選取了S-8、NKA-9為極性樹(shù)脂，AB-8、D-101為弱極性樹(shù)脂，D3520為中極性樹(shù)脂，X-5為非極性樹(shù)脂。

從測(cè)定結(jié)果的對(duì)比中可以看出，考慮了極性和分子量，AB-8樹(shù)脂對(duì)一般顏料和有機(jī)物質(zhì)都有一定的吸附特性，并且有一定的孔徑，比表面積大，比重大，純化后的多糖回收率較高。綜合考慮各種因素，確定高純度的AB-8型樹(shù)脂為最佳純化樹(shù)脂，不同孔徑樹(shù)脂對(duì)多糖純度和回收率分析情況見(jiàn)表1。

表1 不同孔徑樹(shù)脂對(duì)多糖純度和回收率分析情況Table 1 Analysis of polysaccharide purity and recovery rate by resins with different pore sizes

由表1可知，使用AB-8樹(shù)脂，無(wú)花果多糖純度達(dá)到最高，為75%；使用AB-8樹(shù)脂和NKA-9樹(shù)脂，多糖回收率達(dá)到最高，為70%。因此，選用AB-8樹(shù)脂去除多糖中的色素效果最好。

2.4 去除蛋白質(zhì)

無(wú)花果蛋白組分多糖的提取采用傳統(tǒng)的 Sevag法和3%三氯乙酸法，而苯酚-硫酸法用于測(cè)定多糖含量，而雙縮脲法用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量。不同方法除蛋白質(zhì)成分比較見(jiàn)表2。

表2 不同方法除蛋白質(zhì)成分比較Table 2 Comparison of protein components removed by different methods

由表2可知，使用 Sevag法和3%三氯乙酸法多糖損失率相差3%，其中Sevag法多糖損失率較高；而3%三氯乙酸法去除率較高，同樣比Sevag法高3%。但是，使用3%三氯乙酸法易潮解，溶于水、乙醇、乙醚，試驗(yàn)更加方便。

2.5 NaCl洗脫

鹽對(duì)多糖的純化效果較差，但加入鹽可增加樹(shù)脂對(duì)雜質(zhì)的吸附性，但濃度不能過(guò)高，否則會(huì)給以后透析帶來(lái)較大影響。NaCl是一種白色晶體粉末，溶于丁烷后變成等離子體，該物質(zhì)易溶于水，在酒精中分散的 NaCl能形成膠體。氯化氫的存在使其在水中的溶解度下降，在濃鹽酸中幾乎不溶，不易溶于乙醚。

基于此，不同濃度NaCl對(duì)多糖純化的影響分析見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度NaCl對(duì)多糖純化影響分析Fig.2 Analysis of the influence of NaCl with different concentration on the purification of polysaccharides

由圖2可知，當(dāng)NaCl濃度為0.01，0.05 mg/mL時(shí)，無(wú)花果多糖純度在60%以下；而當(dāng)NaCl濃度為0.02，0.03，0.04 mg/mL時(shí)，無(wú)花果多糖純度在60%以上，且當(dāng)NaCl濃度為0.03 mg/mL時(shí)，無(wú)花果多糖純度最高，為76%，經(jīng)綜合考慮，最終選用0.03 mg/mL的NaCl溶液。

2.6 無(wú)花果多糖的分離純化

因?yàn)闊o(wú)花果是多糖的混合物，為了得到均勻的成分，用AB-8型離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離，無(wú)花果用0.03 mg/mL的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。再用苯酚-硫酸法測(cè)定無(wú)花果洗脫液中多糖，AB-8柱層析色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 AB-8柱層析色譜圖Fig.3 AB-8 column chromatography

由圖3可知，在管數(shù)分別為10～20，20～30，30～40，40～50時(shí)出現(xiàn)多糖餾分，選用0.03 mg/mL NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，在管數(shù)為10～20，30～40時(shí)出現(xiàn)脫峰，說(shuō)明這兩個(gè)時(shí)期無(wú)花果多糖的分離純化效果較好。

3 抗氧化性能試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 清除超氧陰離子自由基

超氧自由基是一種常見(jiàn)的自由基，其氧化能力很強(qiáng)。超氧陰離子自由基的清除量是測(cè)定抗氧化活性時(shí)常用的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

通過(guò)周期性的介孔硅膠與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸相互作用產(chǎn)生超氧陰離子， 硝基四氮唑藍(lán)通過(guò)還原作用產(chǎn)生最大吸收量。在該吸收條件下，研究超氧陰離子去除率的吸收變化，吸收度值越小，清除率越高。超氧陰離子的清除活性見(jiàn)圖4。

圖4 超氧陰離子的清除活性分析Fig.4 Analysis of scavenging activity of superoxide anions

由圖4可知，隨著濃度增加，超氧陰離子的清除效率也隨之增加，當(dāng)濃度為500 μg/mL時(shí)，清除效率達(dá)到最低，為50%；當(dāng)濃度為2500 μg/mL時(shí)，清除效率達(dá)到最高，為75%。根據(jù)分析結(jié)果，無(wú)花果清除超氧陰離子效率最高為75%。

3.2 清除羥基自由基

羥基自由基·OH 是一種非?；钴S的活性氧，有很強(qiáng)的氧化能力。由于鄰二氮菲-Fe2+溶液反應(yīng)生成的羥基自由基·OH在空氣中被氧化成鄰二氮菲-Fe3+，此時(shí)溶液呈橙紅色。隨著溶液不斷反應(yīng)，最大吸收峰消失，此時(shí)可以在溶液中繼續(xù)添加鄰二氮菲-Fe2+，通過(guò)褪色程度來(lái)衡量羥基自由基·OH的清除效果。

配制不同濃度的無(wú)花果，測(cè)定其對(duì)羥基自由基·OH的清除率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 羥基自由基·OH的清除率Fig.5 The scavenging rate of hydroxyl radicals

由圖5可知，無(wú)花果多糖在處理過(guò)程中存在一定清除羥基自由基·OH能力，隨著溶液濃度增加，清除率逐漸增強(qiáng)，根據(jù)分析結(jié)果可知，無(wú)花果多糖清除羥基自由基的最高效率為38%。

3.3 還原能力測(cè)試

抗氧化劑提供電子，以自身的還原作用清除羥基自由基·OH。還原力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)；在鐵氰化鉀體系中，F(xiàn)e3+在抗氧化劑促進(jìn)下被還原為Fe2+，F(xiàn)e2+在AB-8柱層析色譜圖中被發(fā)現(xiàn)。吸收度值越大，還原性越強(qiáng)。無(wú)花果多糖的還原能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 無(wú)花果多糖的還原能力測(cè)定結(jié)果Fig.6 Determination results of reducing capacityof fig polysaccharides

由圖6可知，無(wú)花果多糖圖像顯示了一定的還原能力，并且隨濃度的增加逐漸增強(qiáng)。在1000 μg/mL濃度下，還原量最大，吸光度在0.05左右，達(dá)到最高。

3.4 試驗(yàn)結(jié)論

無(wú)花果中多糖組分還原能力與單糖還原端暴露量有關(guān)，如果純化單糖的還原端組分未暴露，那么將直接影響其還原效果。無(wú)花果多糖還具有還原鐵離子作用，隨著無(wú)花果溶液濃度增加，還原程度越高，并且抑制羥基自由基·OH無(wú)規(guī)則轉(zhuǎn)移，保障羥基自由基·OH能夠轉(zhuǎn)變?yōu)楦臃€(wěn)定的產(chǎn)物，使無(wú)花果在反應(yīng)過(guò)程中自動(dòng)終止羥基自由基·OH一系列的反應(yīng)。

通過(guò)上述測(cè)試內(nèi)容可知，當(dāng)濃度為2500 μg/mL時(shí)，無(wú)花果多糖清除超氧陰離子效率最高為75%。當(dāng)濃度為2500 μg/mL時(shí)，無(wú)花果多糖清除羥基自由基的最高效率為38%。在1000 μg/mL濃度下，還原量最大，吸光度在0.05左右，達(dá)到最高。說(shuō)明純化后的無(wú)花果多糖抗氧化活性明顯強(qiáng)于未純化的無(wú)花果。原因在于多糖的活性與分子量、溶解性、黏度和結(jié)構(gòu)有關(guān)，多糖類分子量越大，越不利于跨膜行動(dòng)，多糖分子進(jìn)入生物體進(jìn)行生物活動(dòng)的可能性就越低。小分子多糖更容易結(jié)合，而過(guò)低的活性位點(diǎn)和過(guò)低的分子量會(huì)阻礙活性聚合結(jié)構(gòu)的形成，相對(duì)分子質(zhì)量適宜的多糖活性高。

4 結(jié)束語(yǔ)

無(wú)花果的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，多糖是無(wú)花果果實(shí)的主要活性成分。無(wú)花果多糖的提取、分離純化方法隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步也在不斷更新。相信在未來(lái)無(wú)花果多糖生產(chǎn)中將出現(xiàn)更加高效、環(huán)保的新技術(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，粗多糖具有很強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基的能力，還具有很強(qiáng)的還原能力，由此說(shuō)明無(wú)花果具有很強(qiáng)的抗氧化能力。但是，該試驗(yàn)只對(duì)其體外抗氧化作用進(jìn)行了部分研究。接下來(lái)可通過(guò)在其他物質(zhì)上試驗(yàn)來(lái)研究其在有機(jī)體內(nèi)清除自由基的效果。