響應面法優化納豆芽孢桿菌富硒的發酵條件

紀雅飛，熊琦

(山西大學 生命科學學院，太原 030006)

納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)，屬于枯草芽孢桿菌的一個亞種，是一種可食用益生菌，對人體無病原性[1]。由該菌分泌的糖化酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能將碳水化合物、蛋白質、脂肪等大分子物質分解成低聚糖、小肽、氨基酸、有機酸等易被人體吸收的成分，從而提高營養的利用率[2-3]。該菌能夠在酸性胃環境中保持高度的穩定性[4]，且它的代謝產物具有溶栓[5-6]、抗腫瘤、降低血壓、抗氧化[7]、維持腸道微生態環境平衡的功能[8]。其發酵食品納豆現也成為心血管疾病高發區人群的首選健康食品[9]。

硒被認為是地殼中常見的微量元素，在人體維持正常的生理代謝和健康水平中起到重要作用。但土壤中的硒缺乏是一個世界性的問題[10]，適當補硒可促進腸胃吸收功能，調節免疫功能，降低血液中有毒物質含量如重金屬銅、鎘、鉛化合物等[11]。在各種形式的硒化合物中，有機硒比無機硒的毒性低且生物利用率高[12-13]，但人工合成有機硒難度較大，成本較高，因此采用生物法制備有機硒成為研究熱點。

本研究通過單因素實驗和響應面法優化納豆芽孢桿菌富硒的發酵條件，對樣品進行透析及消化處理，并采用流動注射氫化物-火焰原子吸收光譜法測定有機硒含量[14]，確定最佳有機硒轉化率。納豆芽孢桿菌為可食用益生菌，其對無機硒進行生物轉化獲得的有機硒可省去提取步驟，且該菌的轉化速率較快，降低了制備成本，在為富硒食品提供高效、低成本的生物硒源研究中具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌：山西大學生命科學學院光合細菌實驗室；水中硒標準溶液(5%硝酸)：北京壇墨質檢科技有限公司；硝酸：天津市耀華化學試劑有限責任公司；高氯酸：天津政成化學制品有限公司；硼氫化鉀、亞硒酸鈉、亞甲基藍：天津市風船化學試劑科技有限公司；L-半胱氨酸：北京奧博拓達科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

TU-1810型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；恒溫搖床、立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；AR1140電子分析天平 美國Ohaus公司；數顯恒溫水浴鍋 上海科析實驗儀器廠；85-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；LH-2A型氫化物發生器 北京有色金屬研究總院；A6300火焰原子吸收分光光度計 日本島津(香港)有限公司。

1.2 培養基的配制

牛肉膏蛋白胨培養基：2%葡萄糖、1.5%蛋白胨、0.5%氯化鈉、0.05%牛肉膏，pH值7.0～7.2，在115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化與培養

將4 ℃條件下保存的納豆芽孢桿菌以5%的接種量接入培養基中，在37 ℃、150 r/min培養12 h，活化3次備用。

1.3.2 生長曲線的測定

將活化好的納豆芽孢桿菌以5%的接種量接入60 mL培養基中，在37 ℃、150 r/min恒溫培養，每2 h取樣一次測定OD600 nm值。

1.3.3 樣品處理及測定

1.3.3.1 透析樣品

使用分子量14000的透析袋于超純水中透析樣品，滴加質量濃度為150 g/L的半胱氨酸溶液2～3滴，期間不斷更換超純水，加入適量亞甲基藍溶液，若亞甲基藍保持1 min以上不褪色，則無機硒已被全部析出。

1.3.3.2 消化樣品

取1 mL透析后的樣品加入燒杯中，添加10 mL混酸(硝酸∶高氯酸為4∶1)，放入2～3個玻璃珠冷消化過夜。次日置于電熱板加熱趕酸，待樣品剩余1 mL時冷卻并加入8 mL超純水，重復操作直至無可見白眼冒出，添加1∶1鹽酸8 mL沸水浴10 min，用10%鹽酸定容至25 mL容量瓶中待測。

1.3.3.3 標曲的制作

取0.5 mL硒標準儲備液于100 mL容量瓶中，用超純水定容獲得硒中間液，取5 mL硒中間液于100 mL容量瓶中，用超純水定容獲得硒標準液，分別吸取0，0.5，1，2，3，4，5 mL硒標準溶液于25 mL容量瓶中，加2.5 mL濃鹽酸，用超純水定容獲得質量濃度梯度為0，5，10，20，30，40，50 μg/L的標準溶液，測定硒含量并繪制標準曲線，回歸方程為：Y=0.0047305X-0.00090495，R2=0.9995。

1.3.3.4 有機硒的測定

配制硼氫化鉀與氫氧化鈉混合溶液：將2 g硼氫化鉀、0.2 g氫氧化鈉置于100 mL容量瓶中定容，以氮氣為載氣，10%鹽酸為載流液，測定波長196 nm，乙炔點火測定標曲及樣品硒含量。代入公式(1)計算有機硒轉化率：

公式(1)

式中：N為稀釋倍數；ρ1為所測有機硒質量濃度，μg/L；ρ2為添加亞硒酸鈉質量濃度，μg/mL；M1為亞硒酸鈉相對分子質量；M2為硒相對分子質量。

1.3.4 單因素實驗

將納豆芽孢桿菌作為實驗用菌，以亞硒酸鈉為無機硒源，以有機硒轉化率為最終考核指標,亞硒酸鈉與菌株同時添加，亞硒酸鈉添加量60 μg/mL、培養基初始pH值7、培養時間48 h、接種量5%為初始條件，在其他因素不變的條件下，分別考察單因素:亞硒酸鈉添加時間(亞硒酸鈉與菌株同時添加，培養8，16 h)、亞硒酸鈉添加量(10，30，60，90，120 μg/mL)、培養基初始pH值(5，6，7，8，9)、培養時間(3，6，12，24，48 h)及接種量(1%、3%、5%、7%、9%)對有機硒轉化率的影響。

1.3.5 響應面實驗

通過分析單因素實驗結果進一步確定各因素對有機硒轉化率的影響規律，確定接入菌體同時添加亞硒酸鈉，亞硒酸鈉添加量10 μg/mL為最佳條件，選取培養基初始pH值、接種量及培養時間作為因變量，有機硒轉化率作為響應值，設計三因素三水平的響應面實驗，響應面實驗因素與水平見表1。

表1 納豆芽孢桿菌富硒培養參數的響應面因素與水平Table 1 The response surface factors and levels of selenium-rich culture parameters of Bacillus natto

1.4 數據處理

實驗重復3次，采用Design Expert 8.0.5軟件進行響應面實驗設計、方差分析及回歸分析；采用SPSS 18.0軟件進行單因素實驗方差分析；采用Origin 8.5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌生長曲線

由圖1可知，該菌株接種后幾乎沒有出現延滯期，因為新的培養環境與原有環境基本一致，納豆芽孢桿菌很快適應了新環境并呈指數增長。菌體生長0～14 h納豆芽孢桿菌生長力旺盛，為對數生長期。培養12 h后逐漸進入穩定期。菌體生長18 h后進入衰亡期。本實驗選取培養0(即亞硒酸鈉與菌株同時接入培養基)，8，16 h時加入亞硒酸鈉。

圖1 納豆芽孢桿菌生長曲線Fig.1 Bacillus natto growth curve

2.2 單因素實驗

2.2.1 亞硒酸鈉添加時間對有機硒轉化率的影響

圖2 亞硒酸鈉添加時間對轉化率的影響Fig.2 Effect of sodium selenite adding time on the conversion rate

由圖2可知，納豆芽孢桿菌與亞硒酸鈉同時加入培養基時有機硒轉化率最高，這與孫博等[15]的研究結果相同，亞硒酸鈉能夠抑制菌體生長，不宜過早添加，所以在對數生長初期添加亞硒酸鈉，此時菌體生長代謝旺盛，有機硒轉化率最高，考慮到該菌能夠快速適應新的培養環境，即選取亞硒酸鈉與菌體同時接入培養基為最適亞硒酸鈉添加時間。

2.2.2 亞硒酸鈉添加量對有機硒轉化率的影響

圖3 亞硒酸鈉添加量對轉化率的影響Fig.3 Effect of the additive amount of sodium selenite on the conversion rate

由圖3可知，有機硒轉化率隨著亞硒酸鈉添加量的升高而降低，細菌將亞硒酸鈉轉化為有機硒的過程是其在受到亞硒酸鈉的毒性作用脅迫后的一種自我保護行為，亞硒酸鈉濃度越高，對納豆芽孢桿的毒性作用越大，菌體生長受到抑制[16]，所以該菌在高濃度亞硒酸鈉環境中有機硒轉化率較低，因此選擇10 μg/mL為最適亞硒酸鈉添加量。

2.2.3 培養基初始pH值對有機硒轉化率的影響

圖4 培養基初始pH值對轉化率的影響Fig.4 Effect of initial pH value of culture medium on the conversion rate

由圖4可知，有機硒轉化率隨著培養基初始pH值的增大呈現先升高后降低的趨勢，pH值為7時轉化率最佳。pH對菌體膜滲透性、細胞膜電荷及營養物質離子化程度具有影響作用，從而對其營養的吸收及生長產生影響[17-18]，過酸過堿都不利于納豆芽孢桿菌吸收營養及生長，使有機硒轉化率降低，因此選擇pH值為7作為最適培養基初始pH值。

2.2.4 培養時間對有機硒轉化率的影響

圖5 培養時間對轉化率的影響Fig.5 Effect of culture time on the conversion rate

由圖5可知，培養3～6 h有機硒轉化率顯著升高，結合生長曲線，此時菌體進入新環境，生長旺盛，有機硒轉化率升高較明顯。培養6～12 h轉化率雖有提升但不顯著，此時菌體的生長狀況較前6 h有下降趨勢，加之亞硒酸鈉對菌體生長具有抑制作用，所以有機硒轉化率升高不明顯。培養12 h后轉化率趨于穩定，菌體生長12 h后逐漸進入穩定期，所以有機硒轉化率逐漸趨于平穩，這與靳志強等[19]的研究結果相似。所以選擇6 h為最適培養時間。

2.2.5 接種量對有機硒轉化率的影響

圖6 接種量對轉化率的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on the conversion rate

由圖6可知，接種量為3%時轉化率達到最高，隨著接種量的增大或減小，轉化率有所降低，接種量為9%時轉化率有升高的趨勢但并不顯著。因為接種量對菌種的生長有一定的影響，接種量過小時，導致菌體細胞內的某些維生素和輔基發生擴散，不利于菌種生長；接種量過大時，加快了菌體對培養基的消耗，也不利于菌種的生長[20]。所以選擇3%為最適接種量。

2.3 響應面實驗

2.3.1 實驗結果及回歸分析

以取得有機硒最高轉化率為目的，根據單因素實驗結果，選擇培養基初始pH值(A)、接種量(B)、培養時間(C)作為因變量，有機硒轉化率(Y)作為響應值，設計三因素三水平的響應面實驗，實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計及轉化率Table 2 RSM design and conversion rate

表3 有機硒轉化率回歸模型及顯著性分析Table 3 Organic selenium conversion rate regression model and significance analysis

續 表

由表3可得回歸方程為：Y=88.43+6.90A+7.00B+6.01C+6.65AB+0.54AC+4.59BC-9.88A2-23.96B2-6.03C2。

此模型F=17.59，P<0.01，差異極顯著，表明本次模型建立有意義；R2=0.9577，表明回歸方程擬合度良好，實驗方法可靠，能夠對實驗數據進行分析及預測；失擬項F=4.06，P>0.05，無顯著性差異，說明實驗結果中非正常誤差較小，可由此模型得到有機硒最佳轉化率。結果表明，本實驗因素培養基初始pH值(A)、接種量(B)、培養時間(C)對有機硒轉化率的主次影響順序：B>A>C。一次項A、B和二次項A2、B2對響應值影響極顯著，一次項C和交互項AB對響應值影響顯著，其余項對響應值影響不顯著。

2.3.2 實驗因素交互作用分析

各因素交互作用的響應面圖及等高線圖見圖7～圖9，均采用Design Expert 8.0.5軟件進行繪制。

圖7 培養基初始pH值與接種量對轉化率影響的響應面圖及等高線Fig.7 Response surface plot and contour of the effect of initial pH and inoculation amount on conversion rate

圖8 培養基初始pH值與培養時間對轉化率影響的響應面圖及等高線Fig.8 Response surface plot and contour of the effect of initial pH and culture time on conversion rate

圖9 接種量與培養時間對轉化率影響的響應面圖及等高線Fig.9 Response surface plot and contour of inoculation amount and culture time on conversion rate

響應面法是通過分析自變量之間的相互作用以及自變量對響應值影響優化工藝的方法，是一種用于食品加工中高產和產品質量驗收的技術[21]。本研究通過Design Expert 8.0.5軟件對表2實驗設計所得結果進行分析并繪制各實驗因素間交互作用的響應面圖及等高線圖，等高線的橢圓程度表示兩因素交互作用對響應值影響的顯著性，橢圓程度越大表示影響越顯著[22]。響應面的坡度表示實驗因素對有機硒轉化率的影響大小，坡度越大表示影響越大。

由圖7可知，接種量1%～5%、培養基初始pH值在6～8范圍內，有機硒轉化率先升高后降低。接種量3%、pH 7.0附近值對有機硒轉化率的影響較重要。接種量響應面坡度較大，表明接種量對有機硒轉化率影響較大。等高線橢圓程度大，表明培養基初始pH值與接種量的交互作用明顯。由圖8可知，響應面整體坡度小，隨著培養時間的延長，有機硒轉化率呈現不顯著的升高趨勢，培養基初始pH值在6～8范圍內，有機硒轉化率先升高后降低。等高線橢圓程度小，表明培養基初始pH值與培養時間的交互作用不明顯，結果與顯著性分析一致。由圖9可知，隨著培養時間的延長，有機硒轉化率有不顯著的升高趨勢；隨著接種量的增大，有機硒轉化率呈現先降低后升高的趨勢且響應面坡度較大，結合圖7中結果表明接種量是影響納豆芽孢桿菌有機硒轉化率的重要條件。

2.3.3 最優轉化率實驗條件的確定及驗證

通過Design Expert 8.0.5軟件分析獲得最優發酵條件為：培養基初始pH值7.46，接種量3.54%，培養時間10.30 h，轉化率理論值為92.8194%。考慮到實際操作的難易程度，將培養基初始pH值改為7.5，接種量改為3.5%，培養時間改為10 h。根據上述實驗條件進行3次驗證實驗，所得有機硒轉化率為91.21%，實驗結果與預測值無顯著性差異，表明通過響應面法優化所得的納豆芽孢桿菌富硒培養參數具備可靠性和可操作性。

3 結論

本研究通過響應面法優化了納豆芽孢桿菌富硒的發酵條件，最終確定的優化條件為：接入菌體時添加亞硒酸鈉，接種量為3.5%，亞硒酸鈉質量濃度為10 μg/mL，培養基初始pH值為7.5，培養時間為10 h。通過以上條件所得有機硒轉化率為91.21%。此次研究在為富硒食品提供高效、低成本的生物硒源研究中具有一定的參考價值，且納豆芽孢桿菌對無機硒進行生物轉化獲得的有機硒可省去提取步驟，轉化速率較快，降低了制備成本，具有良好的應用前景。