響應面法優化超臨界萃取花椒籽油及α-亞麻酸的工藝研究

孫睿，張永涵，劉婧瑋,2，宋杰,2，郭秀蘭，Xu Changmou,3，鄒強*

(1.成都大學 藥學與生物工程學院，成都 610106；2.四川省輕工業研究設計院，成都 610081；3.美國內布拉斯加大學林肯分校，內布拉斯加州 68588)

花椒是蕓香科植物青椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc.)或花椒(Z.bungeanumMaxim.)的干燥成熟果實，是我國“八大調味料”之一，其味辛，性溫，歸脾、胃、腎經。花椒用藥歷史悠久[1]，我國很多地區都可見花椒的身影，其中四川花椒的食用、藥用和栽培歷史都相當悠久，共觀測到花椒種資源37個[2]，花椒產量約占全國總量的17.6%。花椒籽是花椒調味料的主要副產物，被大量浪費。花椒籽中不飽和脂肪酸含量高達78.4%[3]。其中α-亞麻酸是人體必需的脂肪酸，不能自身合成，通常從食物中獲取[4]。α-亞麻酸具有促進幼兒生長和其他健康益處，比如它的抗凝血性能，能降低心臟方面問題的風險[5-6]。

超臨界CO2萃取技術操作溫度低、選擇性好，且CO2具有無毒、價廉等特點，還能夠很好地保留花椒香料的天然香氣[7-8]。目前有多位學者以花椒籽為原料采用超臨界CO2萃取技術做出了許多探究，劉雄等[9]通過正交實驗研究表明超臨界CO2萃取花椒籽油的最佳條件為：原料粒度60目，萃取時間6 h，流量25 kg/h，溫度50 ℃，壓力45 MPa，此時花椒籽的出油率為93.63%。張淼等[10]研究表明正己烷結合超臨界CO2萃取花椒籽油最優提取率為13.7%。劉通等[11]研究表明超臨界CO2萃取花椒籽油的最優提取率下亞麻酸含量為39.2%。Devi等[12]研究了超臨界CO2萃取大麻籽中α-亞麻酸時各因素對萃取結果的影響，實驗結果表明原料粒徑越小，α-亞麻酸含量越高，隨著超臨界CO2溫度、壓強、CO2流速的升高與乙醇夾帶劑質量的增多出現先增加后減少的趨勢。鮮少有人對花椒籽油的超臨界CO2萃取與其中α-亞麻酸相對含量工藝條件進行同時優化，本文采用響應面法同時優化花椒籽的超臨界CO2萃取和α-亞麻酸含量的工藝研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青花椒籽：由四川三臺圣菲倫食品公司提供；氫氧化鈉、氯化鈉：分析純；三氟化硼-甲醇溶液(濃度為15%)、正庚烷、甲醇：均為色譜純；氣體：CO2純度大于99.9%。

1.2 儀器設備

HA221-40-11型超臨界CO2萃取裝置 南通市華安超臨界萃取有限公司；7890B型氣相色譜儀 美國安捷倫公司；DZF-6020型真空干燥箱、SECURA213-1CN型電子天平、高速萬能粉碎機、電熱恒溫水浴鍋。

1.3 超臨界CO2萃取方法

取適量花椒籽于干燥箱中60 ℃烘3 h，粉碎過篩(20目)后備用。每次試驗時準確稱取花椒籽粉末200 g于超臨界萃取釜內，通過改變萃取溫度、時間和壓力來進行超臨界CO2萃取。其中CO2流量在壓力穩定的情況下恒定不變。萃取結束后將花椒籽油稱重，并用GB5009.168-2016中第三法(歸一化法)來測定其中α-亞麻酸的相對含量。花椒油的得率按照下式計算：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 壓力對萃取效果的影響

在溫度為50 ℃，萃取時間為90 min時，通過設定不同的壓力來進行試驗，探討壓力對萃取結果的影響，結果見圖1。

圖1 萃取壓力對萃取結果的影響Fig.1 The effect of extraction pressure on the extraction results

由圖1可知，花椒籽的提油率和α-亞麻酸含量隨著壓力的升高而逐漸增加。初始時，花椒籽油脂在CO2中溶解的不多。隨著壓力的增加，油脂更多地溶解在CO2中。這是因為當溫度一定時，隨著壓力的增大，超臨界CO2的密度也會相應增大，從而使得花椒籽油在CO2中的溶解度增加，出油率和α-亞麻酸含量隨壓力升高而增加。當壓力達到一定值后，對CO2的溶解度影響變小，所以提油率和α-亞麻酸含量會變平穩。此儀器最高壓力要低于40 MPa，壓力升高，對儀器設備要求會更高，安全隱患會更大。綜合考慮，確定3個壓力水平為25，30，35 MPa。

2.1.2 溫度對萃取效果的影響

在壓力為30 MPa，萃取時間為90 min時，通過設定不同的溫度來進行試驗，探討溫度對萃取結果的影響，結果見圖2。

圖2 萃取溫度對萃取結果的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the extraction results

由圖2可知，隨著溫度的升高，加快了油溶于CO2中，分子作用力加快，所以此時出油率和α-亞麻酸含量隨溫度升高而增加；而在后期，隨著溫度的升高反而降低了溶劑的CO2密度，從而降低了溶解在超臨界CO2中的溶質，因此隨溫度升高而降低。由此確定3個溫度水平為45，50，55 ℃。

2.1.3 時間對萃取效果的影響

在壓力為30 MPa，溫度為50 ℃時，通過設定不同的時間來進行試驗，探討時間對萃取結果的影響，結果見圖3。

圖3 萃取時間對萃取結果的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction results

由圖3可知，隨著時間的增加，提油率和α-亞麻酸含量會隨之增加，而在達到90 min后已無太大變化。因此確定3個時間為60，90，120 min。

2.2 響應面試驗設計及結果

根據上面單因素試驗結果，以萃取壓力、溫度、時間3個因素為自變量，以花椒籽油的得率和α-亞麻酸的含量為響應值，每個取3個水平并編碼-1，0，1，并根據單因素試驗結果選定3個因素的零水平和波動區, 采用Box-Benhnken試驗設計的水平編碼見表1，試驗結果見表2～表4。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 The factors and levels of response surface test

表2 響應面試驗設計和結果Table 2 The results of response surface experimental design

續 表

根據表2設計水平，采用Design-Expert軟件對提油率和α-亞麻酸含量進行擬合，得到二次多項回歸方程，提油率：Y1=+12.45-0.31A+0.55B+0.10C+0.011AB-0.16AC-0.043BC-1.55A2-0.97B2-0.39C2；α-亞麻酸含量：Y2=+4.52+0.22A-0.15B+0.011C-0.23AB-0.31AC-0.010BC-0.57A2-0.35B2-0.72C2。

表3 提油率回歸方程方差分析表Table 3 The regression equation anova table of oil extraction rate

表4 α-亞麻酸含量回歸方程方差分析表Table 4 The regression equation anova table of α-linolenic acid content

續 表

由表3中F值可知，提油率的影響因素由大到小為：萃取溫度B>萃取壓力A>萃取時間C；由表4中F值可知，花椒籽油中α-亞麻酸含量的影響因素由大到小為：萃取壓力A>萃取溫度B>萃取時間C。

由表3和表4可知，表3中的P值<0.0001，表4中的P值為0.0003，說明該模型極顯著；失擬項分別0.1116和0.1895，均大于0.05，表明兩個模型失擬項不顯著，擬合程度較好。兩個模型的決定系數(R2)分別為0.9872和0.9651，說明方程的回歸效果好，調整確定系數(RAdj2)分別為0.9707和0.9202，說明兩個模型可信度高，試驗誤差較小，能較好地預測花椒籽的提油率和油中α-亞麻酸含量隨著壓力等因素變化的規律。

2.3 響應面結果分析

將模型其中一個影響因素固定為0，繪制其余兩個因素對花椒籽的提油率以及α-亞麻酸含量影響的等高線圖及響應曲面，見圖4和圖5。

a.萃取壓力和溫度

b.萃取壓力和時間

c.萃取溫度與時間

a.萃取壓力與溫度

b.萃取壓力與時間

c.萃取溫度與時間

根據圖4響應面及圖中等高線圖的形狀分析萃取壓力、溫度、時間3個因素對花椒籽提油率的影響。等高線的形狀反映交互作用的強弱，圓形表示兩個因素之間交互作用比較弱，而橢圓形則表示兩個因素之間交互作用較強，由圖4中a和b可知，因素A和B、A和C的交互作用較弱，由圖4中c可知，因素B和C的交互作用較強。由圖4中a可知，在時間為90 min時，隨著萃取壓力和溫度的提升，花椒籽的提油率有著先增大后減小的趨勢。在壓力為27.2～32.1 MPa，萃取溫度48.5～53.4 ℃時，提油率在較高范圍內。由圖4中b可知，在溫度為50 ℃時，隨著萃取壓力和時間的增加，提油率先增大后減小。在壓力為28.5～31.5 MPa，萃取時間為75～114 min時，提油率較高。由圖4中c可知，在壓力為30 MPa時，隨著萃取溫度和時間的提高，提油率也呈現先增大后減小的趨勢。在溫度為50.5～52.5 ℃，萃取時間為84～102 min時，提油率達到較高水平。

根據圖5響應面及圖中等高線圖的形狀分析萃取壓力、溫度、時間3個因素對花椒籽α-亞麻酸含量的影響。由圖5中b和c可知，因素A和C、B和C的交互作用較強，由圖5中a可知，因素A和B的交互作用較弱。由圖5中a可知，在時間為90 min時，隨著萃取壓力和溫度的提升，花椒籽的α-亞麻酸含量有著先增大后減小的趨勢，溫度對其影響更大，表現在響應面曲面更陡。在萃取溫度為45～51.2 ℃，壓力為29～34.2 MPa時，α-亞麻酸含量處于較高水平。由圖5中b可知，在溫度為50 ℃時，隨著萃取壓力和時間的增加，α-亞麻酸含量先增大后減小。在壓力為29～32.5 MPa，萃取時間為78～96 min時，α-亞麻酸含量處于較高水平。由圖5中c可知，在壓力為30 MPa時，隨著萃取溫度和時間的提高，α-亞麻酸含量也呈現先增大后減小的趨勢。在溫度為46～52.1 ℃，萃取時間為78～102 min時，α-亞麻酸含量在較高范圍內。

對軟件進一步分析，提油率的最佳條件為：壓力為32.58 MPa，溫度為51.55 ℃，時間為90.19 min；α-亞麻酸含量的最佳條件為：壓力為34.89 MPa，溫度為47.49 ℃，時間為85.03 min。

經過對回歸模型的數學分析，發現要得到最佳提油率與α-亞麻酸含量的條件并不完全相同，說明兩個響應值(Y1與Y2)相互制約[13]。通過上面對兩個模型的響應曲面與等高線分析以及各因素對響應值的影響順序，選擇最佳工藝條件為：萃取壓力30.3 MPa，萃取溫度51.2 ℃，萃取時間89.6 min，提油率預測值為12.50%，α-亞麻酸含量的預測值為4.48%。

3 驗證試驗

根據分析結果，將試驗條件稍作修改以方便進行。壓力調整為30 MPa，溫度為51 ℃，時間為90 min。在此條件下進行3次驗證試驗，得到的提油率平均為12.52%，此時α-亞麻酸含量平均為4.45%。從本試驗可以看出花椒籽提油率和α-亞麻酸含量采用響應面同步優化法進行模擬，其數學回歸模型的預測值與實測值非常接近，偏差較小，說明該回歸模型具有可靠性。

本試驗提取的花椒籽油提油率與α-亞麻酸含量等與其他學者研究的花椒籽油有所差異，可能是與花椒籽的品種、采摘后續處理技術等不同有關[14-15]。

花椒籽油脂肪酸氣相色譜圖見圖6，花椒籽油脂肪酸組成見表5。

圖6 花椒籽油脂肪酸氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of fatty acids of Zanthoxylum bungeanum seed oil

表5 花椒籽油脂肪酸組成Table 5 The fatty acid composition of Zanthoxylum bungeanum seed oil

4 結論

根據單因素試驗的結果，以提油率與α-亞麻酸含量分別為兩個自變量，確定了壓力、溫度與時間3個因素的3個水平，用Box-Benhnken試驗設計模型擬合，得到花椒籽提油率影響因素由大到小為：萃取溫度>萃取壓力>萃取時間；α-亞麻酸含量影響因素由大到小為：萃取壓力>萃取溫度>萃取時間；進一步優化得到試驗最佳條件：壓力30 MPa，溫度51 ℃，時間90 min，在此最佳優化條件下，花椒籽的提油率為12.52%，α-亞麻酸含量為4.45%。