4種龜肉酶解液的氨基酸對比分析

黃百祺，楊昭，王如意，黃創成，吳巨賢，鄒琴*

(1.廣東科貿職業學院 食品與生物工程學院，廣州 510430；2.廣東食品藥品職業學院實驗實訓中心，廣州 510430；3.四會市康源水產養殖場，廣東 肇慶 526200)

廣東省是我國龜鱉類動物養殖規模最大的省份之一。據統計，廣東省食用龜養殖存量上中國龜種以黃喉擬水龜(Mauremysmutica，俗稱石金錢，以下簡稱石龜)最多，其次為中華草龜(Chinemysreevesii，以下簡稱草龜)、中華花龜(Ocadiasinensis，以下簡稱花龜)，外國龜種以鱷龜(Chelydraserpentina)最多[1]。研究表明，石龜、草龜、花龜、鱷龜肉粗蛋白含量約為17%[2-4]，其氨基酸組成比例符合FAO/WHO的推薦標準，是一種高蛋白、低脂肪的肉類和優質的蛋白質來源。目前，對這4種龜肉的利用仍以鮮食為主，隨著養殖技術不斷提高和規模逐步擴大，以及對龜肉生理活性作用的深入研究[5]，人們對龜肉食用價值的認識進一步提高，對龜肉深加工制品也提出了新的要求。酶解技術是制備肉類衍生化、高值化深加工產品的有效方法之一。肉類經酶水解后產生大量溶解性好、易于吸收消化的短肽和游離氨基酸，其在一定條件下能與還原糖、脂類等物質發生反應，產生肉味和烹調效果的香氣[6]。

利用酶解技術制備肉類水解蛋白時，由于不同蛋白酶在水解方式和酶切位點上存在差異，導致酶解產物中游離氨基酸的組成和含量不同，直接影響其風味，故蛋白酶的選擇至關重要[7]。復合蛋白酶既有內切酶，也有外切酶，利用其制備酶解產物時在風味、氨基酸含量等方面具有一定優勢。徐永霞等[8]選用復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等對藍蛤進行單酶酶解，結果表明復合蛋白酶組中游離氨基酸總量最高，酶解液的風味較佳；李冬梅等[9]研究了不同蛋白酶對蝦頭水解物風味的影響，發現復合蛋白酶水解液中的多肽含量及其美拉德反應產物中的鮮味氨基酸含量最高；陳宇等[10]研究發現經復合蛋白酶處理的鹵鴨在色澤、形態等感官指標方面較單一酶更佳。

目前，關于上述4種龜肉精深加工特別是酶解工藝的研究報道較少，限制了其商業價值和資源的高值化利用。本實驗采用復合蛋白酶對石龜、草龜、花龜、鱷龜肉進行酶解，對比不同龜肉酶解產物中總氨基酸和游離氨基酸的組成和含量，對其進行營養評價并分析酶解產物的呈味特性，為4種龜肉的開發利用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃喉擬水龜、中華草龜、中華花龜、鱷龜：由四會市康源水產養殖場提供；胰蛋白酶(酶活4000 U/g)：重慶市全新祥盛生物制藥有限公司；風味蛋白酶(酶活500 LAPU/g)：丹麥諾維信公司；氨基酸混合標準品：美國Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ME204E電子天平、FE20 pH計 梅特勒-托利多有限公司；JYS-A960絞肉機 九陽股份有限公司；BWS-12精密恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司；3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；L8900全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

將活龜去頭放血，取可食用部位肉，用絞肉機絞碎混勻，在-18 ℃低溫保存，備用。

1.3.2 酶解液制備

將凍藏龜肉置于室溫溶解后，準確稱取50 g，加入8倍蒸餾水，打漿后調pH至7.0，分別加入漿液總重量0.6%的胰蛋白酶和0.3%的風味蛋白酶，攪拌均勻后置于500 mL三角瓶中，在55 ℃水浴搖床中酶解3 h。酶解結束后，將盛有酶解液的三角瓶置于水浴鍋中95 ℃滅酶20 min。將酶解液在室溫冷卻后，在 4 ℃條件下以8000 r/min離心10 min，取上清液即為龜肉酶解液，在-18 ℃凍存備用[11]。

1.3.3 氨基酸測定

總氨基酸和游離氨基酸的測定參考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》，采用全自動氨基酸分析儀測定16種氨基酸的含量。由于采用酸水解法處理樣品，故未檢測色氨酸含量。

1.4 數據分析

總氨基酸分析：分別統計總氨基酸(total amino acid，TAA)含量、必需氨基酸(essential amino acid，EAA)含量、非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)含量[12]。游離氨基酸分析：分別統計總游離氨基酸(total free amino acid，TFAA)和呈味氨基酸的含量。游離氨基酸呈味強度值(taste activity value，TAV)是指某游離氨基酸的含量與該游離氨基酸呈味閾值的比值[13]。所有測定均進行3次重復實驗，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 4種龜肉酶解液總氨基酸分析

由表1可知，4種龜肉的酶解液中均檢測到16種氨基酸，表明這4種龜肉中氨基酸的種類較豐富，但在總氨基酸含量上存在差異，4種龜肉酶解液總氨基酸含量大小依次為草龜>花龜>石龜>鱷龜，分別為23.577，23.004，22.936，21.849 mg/g。4種龜肉酶解液中含量最高的3種氨基酸排列規律相同，均為谷氨酸最高，其次為天冬氨酸和賴氨酸，含量最低的氨基酸均為蛋氨酸，與文獻[2]和文獻[3]一致，表明這幾種氨基酸在部分龜鱉科動物中的分布可能具有一定規律性。草龜肉酶解液中谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸的含量均為4種龜肉酶解液中最高，最低均為鱷龜肉酶解液，這可能與4種龜肉酶解液的總氨基酸含量大小存在關聯性。4種龜肉酶解液中均有12種氨基酸的含量>1.0 mg/g，且種類均相同；脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、蛋氨酸這4種氨基酸在4種龜肉酶解液中的含量均<1.0 mg/g。

表1 4種龜肉酶解液總氨基酸分析Table 1 The analysis of total amino acids of enzymatic hydrolysates of four kinds of Emydidae meat

續 表

龜肉酶解產物作為呈味基料，不僅要求其具有良好的風味感官，還需要有較好的營養價值。而營養價值主要取決于其所含的EAA種類和組成比例，EAA組成比例與人體所需氨基酸比例越接近，則其品質越佳。4種龜肉酶解液中均含有7種EAA，EAA總量大小依次為草龜(9.271 mg/g)>花龜(9.134 mg/g)>石龜(9.088 mg/g)>鱷龜(8.284 mg/g)肉酶解液，EAA/TAA分別為39.32%、39.71%、39.61%、37.91%，EAA/NEAA分別為64.81%、65.85%、65.62%、61.07%。根據FAO/WHO規定的EAA/TAA為40%、EAA/NEAA為60%的標準，花龜、草龜、石龜肉酶解液的EAA/TAA較接近40%，EAA/NEAA均>60%，表明這3種龜肉酶解液的營養價值較高。

2.2 4種龜肉酶解液游離氨基酸分析

游離氨基酸不僅大部分本身具有特殊滋味，而且可以通過脫羧、脫氨等作用生成其他揮發性風味物質，對食物的整體風味產生重要影響，還可作為Maillard反應的底物，為酶解產物制備熱反應型肉味香精提供物質基礎[14]。

表2 4種龜肉酶解液游離氨基酸分析Table 2 The analysis of free amino acids of enzymatic hydrolysates in four kinds of Emydidae meat

由表2可知，4種龜肉酶解液中均含有16種游離氨基酸。TFAA含量最高的是花龜肉酶解液(11.058 mg/g)，其次為草龜肉酶解液(10.449 mg/g)、石龜肉酶解液(10.087 mg/g)，最低為鱷龜肉酶解液(9.077 mg/g)。4種龜肉酶解液TFAA的大小排序與其TAA的順序不完全一致，這可能是由于不同種類龜肉蛋白質結構存在差異，導致復合蛋白酶對其切割方式和效率不同。4種龜肉酶解液中含量和百分比最高的兩種FAA均為賴氨酸、亮氨酸，這與兩者在4種龜肉酶解液總氨基酸中的含量和百分比排序所處位置不一致，推測本實驗所用的復合蛋白酶對這兩種氨基酸的酶切位點有偏好性。草龜肉酶解液的賴氨酸含量最高(1.463 mg/g)，石龜肉酶解液的亮氨酸含量最高(1.349 mg/g)，而這兩種氨基酸在TFAA中的百分比均以鱷龜肉酶解液最高。石龜、草龜、花龜、鱷龜肉酶解液的FAA分別有2，3，3，2種氨基酸含量>1.0 mg/g，與TAA中含量>1.0 mg/g的氨基酸均有12種，相比較少，說明酶解液中大部分的氨基酸以可溶性蛋白質或短肽形式存在。

4種龜肉酶解液中游離氨基酸的EAA/TFAA(58.06%～61.06%)、EAA/NEAA(138.43%～156.91%)明顯大于其在總氨基酸中的對應值，均高于FAO/WHO的推薦值，與鯽魚肉酶解液中的對應值相當，高于金槍魚、斑點叉尾鮰魚魚頭等水產品酶解產物中的對應值[15-16]。

2.3 酶解液呈味特性和TAV分析

游離氨基酸是肉類酶解液重要的呈味物質，大部分有著獨特的滋味，呈現出甜味(Ala、Gly、His、Pro、Ser、Thr)、鮮味(Asp、Glu、Lys)以及苦味(Arg、Ile、Leu、Met、Val)，其絕對含量及相對比例會直接影響食物的鮮美程度，而一般認為芳香族氨基酸(Phe、Tyr)無味或呈味特征不明確。

圖1 4種龜肉酶解液呈味氨基酸含量Fig.1 The content of flavor amino acids in enzymatic hydrolysates of four kinds of Emydidae meat

由圖1可知，在呈味氨基酸總量上，花龜肉酶解液最高，其次為草龜肉酶解液、石龜肉酶解液，鱷龜肉酶解液最低。4種龜肉酶解液中呈味氨基酸各種類的組成比例相似，貢獻較大的有苦味氨基酸和鮮味氨基酸，甜味氨基酸含量較少，芳香族氨基酸最少。苦味氨基酸含量最高的為花龜肉酶解液，其次為草龜肉酶解液，石龜、鱷龜肉酶解液較少；鮮味氨基酸含量以草龜、石龜肉酶解液較高；甜味氨基酸含量最高的是花龜肉酶解液，其他幾個品種龜肉酶解液較為接近；對于芳香族氨基酸，石龜、草龜、花龜肉酶解液含量較相近，鱷龜肉酶解液略低。總體上，呈味氨基酸的種類與含量與龜肉味甘、咸平的風味特性較吻合，推測氨基酸與其風味存在一定內在聯系。

由于各種呈味氨基酸的味覺感知閾值不同，因此，雖然不同氨基酸在4種龜肉酶解液中的含量存在差異，但含量高的氨基酸對酶解液風味的貢獻不一定大，故利用TAV對4種龜肉酶解液中的各呈味氨基酸進行評價。當TAV<1時，表示該氨基酸對酶解液整體風味貢獻不大，TAV越大，表示其對風味貢獻越大。

表3 4種龜肉酶解液呈味氨基酸TAV分析Table 3 The TAV of flavor amino acids in enzymatic hydrolysates of four kinds of Emydidae meat

續 表

由表3可知，經過TAV變換后，在所有TAV>1的氨基酸中，除花龜肉酶解液的蛋氨酸外，4種龜肉酶解液中均有6種氨基酸TAV>1，且種類相同，分別為谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、精氨酸和苯丙氨酸，表明這6種氨基酸對龜肉酶解液的風味有重要影響，但其對不同龜肉酶解液風味的貢獻程度不一。總體上，苦味氨基酸和鮮味氨基酸對4種龜肉酶解液的呈味特性貢獻較大。石龜、草龜肉酶解液中TAV最高的氨基酸是谷氨酸，其次分別為纈氨酸、精氨酸，谷氨酸在呈味氨基酸中的鮮味最強，是重要的鮮味劑，纈氨酸具有抑甜作用，精氨酸有提高鮮度和增加呈味復雜性的作用[17]。精氨酸是花龜肉酶解液中TAV最高的氨基酸，其次為谷氨酸。鱷龜肉酶解液中TAV最高的氨基酸是組氨酸，其次為谷氨酸，組氨酸是半必需氨基酸，有增加呈味復雜性和提升鮮度的作用，在火腿中含量較高。

3 結論

本實驗采用復合蛋白酶對石龜、草龜、花龜和鱷龜肉進行酶解，利用氨基酸自動分析儀對4種龜肉酶解液中的總氨基酸和復合氨基酸進行對比分析。結果表明，4種龜肉酶解液的總氨基酸中均檢測到16種氨基酸，均以谷氨酸最高、蛋氨酸最低，總含量最高的為草龜肉酶解液。花龜、草龜、石龜肉酶解液的EAA/TAA、EAA/NEAA與FAO/WHO標準較接近，表明這3種龜肉酶解液的營養價值較高。

4種龜肉酶解液的游離氨基酸中均含有16種氨基酸，總含量最高的是花龜肉酶解液，最低的是鱷龜肉酶解液；含量最高的游離氨基酸均為賴氨酸。4種龜肉酶解液游離氨基酸的EAA/TFAA、EAA/NEAA明顯大于其總氨基酸中的對應值，高于部分水產品的酶解產物。呈味分析顯示，呈味氨基酸總量上以花龜肉酶解液最高，鱷龜肉酶解液最低。4種龜肉酶解液呈味氨基酸種類的組成比例相似，均有種類相同的6種呈味氨基酸TAV>1，但其對不同龜肉酶解液風味的貢獻作用有較大差異，苦味氨基酸和鮮味氨基酸對風味貢獻較大。本實驗為養殖龜可食用部位肉的酶解產物作為呈味基料的應用提供了理論依據，為龜肉深加工產品的開發方向提供了參考。