基于Maillard反應的發酵黑化技術在果蔬加工中的研究進展

張琳，高琳，張仁堂

(山東農業大學 食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東 泰安 271018)

果蔬等農產品加工產業是我國食品工業的重要組成部分，而我國果蔬產品的主要加工方式依然是較為傳統的脫水、冷凍、腌漬和罐藏等，這樣的加工方式使得果蔬產品的相對附加值較低。我國果蔬播種面積在2017年已達3111.7萬公頃，相較于2013年增長了28%[1]，這意味著我國果蔬產業已經進入到了快速發展的階段，這也為果蔬加工業帶來了新的機遇和挑戰。果蔬產業的快速增長為果蔬加工企業帶來了充足的加工原料，但由于相對固定的產品種類，導致市場已經趨于飽和。若果蔬加工企業不進行加工技術的創新，將會導致大量果蔬產能過剩，從而影響到種植戶的收益及整個果蔬產業的發展。因此，果蔬加工業的高效發展不僅需要從源頭上提高果蔬的品質，更需要開發出更多適宜果蔬加工的新技術，發酵黑化技術便由此應運而生。

發酵黑化技術是一種以美拉德反應(Maillard reaction，MR)為主的自身發酵技術，因其操作簡單、方便，故可廣泛用于加工還原糖含量較高的果蔬。同時，隨著消費者對“黑色”食品的越發關注，越來越多的消費者開始接觸并認可發酵黑化果蔬產品，如發酵黑蒜、發酵黑化紅棗等，這也為發酵黑化果蔬產業的發展奠定了堅實的市場基礎。

1 發酵黑化技術

1.1 發酵黑化的原理

發酵黑化是在高溫高濕且不添加任何添加劑的條件下，利用美拉德反應，使食品中蛋白類氨基化合物與糖類羰基化合物反應生成褐色大分子含氮化合物——類黑精和大量小分子物質的一類自身發酵反應。在發酵過程中多糖不斷分解為單糖和雙糖，使食品的甜度得到增強。而酚類化合物、類黑精和雜環化合物含量的增加，使食品的抗氧化能力得到增強[2]，從而在功能作用方面有較大提升。此外，食品中的蛋白質分解為游離氨基酸，有機酸含量也得到增加，使得其口感和風味變得更加豐富。

由于美拉德反應較為復雜，國內外對于其反應機理、路徑和產物的相關研究還不清晰。美國化學家John Hodge也僅對美拉德反應機理做了初步解釋，并將其分為初期反應、中期反應和后期反應三個階段[3]，但其中間產物和整個過程仍缺乏科學合理的解釋。目前，大部分針對美拉德反應的研究都是基于模式美拉德體系[4]，以單種氨基化合物和單種羰基化合物分別作為底物進行反應產物的研究。而在實際生產過程中，由于參與美拉德反應的底物較為多樣且反應條件各不相同，因此反應產物也較為豐富，可大致分為含氮雜環化合物、環狀烯醇化合物、多羰基化合物和單羰基化合物[5]。因此，不同的食品經發酵黑化得到的反應產物和發酵黑化效果也并不完全一致，這與參與美拉德反應的氨基酸和糖的種類及數量有關，參與反應的氨基酸和糖的種類越多，反應產物的風味越豐富[6]。

1.2 發酵黑化的分類

1.2.1 固態發酵黑化

固態發酵黑化是指對物料只進行簡單的物理修整并保留其原有狀態，在高溫高濕的條件下進行恒溫或變溫的一種自身熟化發酵。在果蔬發酵黑化加工中，固態發酵是最常用的方法。固態發酵黑化工藝流程主要包括挑選修整、清洗、水分調整、高溫高濕發酵、殺菌包裝等步驟，其中前處理和高溫高濕發酵是影響產品質量的重要因素[7]。果蔬品種的篩選、修整或切分后體積的大小、發酵時溫濕度的把控等對最終產品的品質有著直接影響。因此，相較于液態發酵，固態發酵的品質控制難度更高。但經固態發酵黑化后的產品在再加工性上強于液態發酵黑化產品，且果蔬整體利用率更高。

1.2.2 液態發酵黑化

液態發酵黑化是對果蔬進行破碎后或加水破碎后，在高溫高濕條件下進行恒溫或變溫的一種自身熟化發酵。液態發酵黑化工藝流程主要包括挑選清洗、修整破碎、調整發酵環境、密封高溫發酵、無菌包裝等步驟。相較于固態發酵，液態發酵最顯著的優勢體現在縮短了發酵時間和提高了發酵可控性及發酵度。此外，相關研究發現液態發酵可顯著提高發酵物中的總酚等活性物質的含量[8]，這對產品的抗氧化功效有較大的提升作用。

2 發酵黑化技術在果蔬加工中的應用

2.1 黑蒜的加工

成品黑蒜色澤黑亮，口感酸甜[9]，且無大蒜原有的辛辣味和刺激性氣味。相較于大蒜，黑蒜在抗氧化方面有顯著提高[10-11]，具有一定的保健作用。我國的黑蒜加工技術最早是由韓國、日本引進，后經不斷改良和優化，如今國內發酵黑蒜的加工工藝已較為成熟。按照發酵時間的長短，可分為傳統發酵和快速發酵兩種發酵方式；按照發酵方式，可分為固態發酵和液態發酵，國內黑蒜的生產以固態發酵為主；按照不同的預處理方式，可分為微波預處理制備黑蒜、低溫冷凍預處理制備黑蒜、高溫預處理制備黑蒜、超高壓預處理制備黑蒜等[12-18]。此外，不同品種大蒜加工得到的黑蒜，其感官品質也不盡相同[19]。姜雪[20]研究發現，多瓣黑蒜產品中的水分、氨基態氮和總酸含量均高于獨頭黑蒜產品，而獨頭黑蒜中的5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF)、還原糖和總酸含量則高于多瓣黑蒜。

2.2 發酵黑化紅棗的加工

發酵黑化紅棗是利用發酵黑化原理加工制備而成[21]，制得的黑棗酸甜可口、棗香味濃郁[22]。孫欣等[23]研究發現，相較于紅棗，黑變發酵棗中果糖、葡萄糖等還原糖含量和總酸含量有所增加；多糖、總酚、三萜酸、氨基酸和5-HMF等功能成分也有所增加[24]；具有焦糖氣味的2-乙酰呋喃(2-acetyl furan)、糠醛(furfural)及其衍生物等明顯增加，使黑變紅棗棗香味更加豐富。由于在加工過程中類黑精的集聚，從而導致發酵黑化紅棗在感官特征上表現為黑色，且與天然黑棗不同的是其黑色同時表現在棗皮和棗肉上。此外，發酵黑棗在抗氧化等活性功能上有著顯著提高[25]，Ju-Yeon H等[26]利用1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、超氧化物歧化酶(SOD)類活性、鄰苯三酚、亞硝酸鹽清除能力和黃嘌呤氧化酶對紅棗和發酵黑棗提取物的抗氧化活性進行了研究，發現發酵黑棗的綜合抗氧化能力顯著優于紅棗。

2.3 黑洋蔥的加工

黑洋蔥是將洋蔥經前處理、控溫自然發酵黑化后制得的一種洋蔥深加工產品[27]，在發酵黑化過程中不僅去除了洋蔥的刺激性氣味，還提高了其抗氧化能力[28]，而美拉德反應產物中大量存在的糠醛和吡嗪賦予了黑洋蔥獨特的風味[29]。寧月寶等[30]研究發現，洋蔥中的蒜氨酸和脫氧蒜氨酸等含硫化合物在發酵過程中會發生降解，而正是這些復雜的揮發性含硫化合物的降解消除了洋蔥中原有的刺激性氣味。Alicia等[31]研究發現在發酵黑化過程中，黑洋蔥中的主要有機硫化合物——異蒜素含量急劇增加，而黃酮含量顯著降低；果糖和葡萄糖的顯著增加使黑洋蔥更加甜口。此外，黑洋蔥中有機硫化物和多酚等活性物質有所增加，能提高對自由基的清除能力，起到降低血糖活性、緩解糖尿病、降低膽固醇、抑制細菌繁殖、延緩衰老和預防癌癥等作用[32-34],可作為一種天然的抗氧化劑。

2.4 熟化黑枸杞的加工

熟化黑枸杞又稱為熟制黑枸杞，胡云峰等[35]采用前期預處理、中期熟化處理和后期干燥定型處理三步熱處理工藝，加工得到色澤黑褐、口感酸甜藥香味濃郁的熟化黑枸杞。熟化黑枸杞不同于自然生長的黑枸杞，其所表現的黑色是由于加工過程中美拉德反應產物的集聚所致，如類黑精等。在熟化過程中，枸杞中總酚和黃酮含量隨時間不斷升高，總酚含量由10.34 mg GAE/g上升到22.94 mg GAE/g，黃酮含量也由1.88 mg RE/g上升到8.10 mg RE/g，使得其抗氧化能力得到顯著提升；此外，熟化黑枸杞中較高含量的2-甲基丁醛(2-methylbutyraldehyde)、糠醛及3-甲基丁醛(3-methylbutyraldehyde)等揮發性化合物賦予了熟化黑枸杞獨特的藥香味[36]。

2.5 黑荸薺的加工

黑荸薺是以新鮮荸薺為原料，采用變溫發酵黑化技術熟化制成[37]。經發酵黑化后的黑荸薺不僅提高了某些特定營養物質的含量，如還原糖和多糖等，在酚類和類黑精等功能活性物質的含量上也有所增加，尤其是類黑精的積累最為顯著。而類黑精的積累提高了產品的抑菌性、抗氧化性和抗腫瘤等功效[38]，由此賦予了黑荸薺一定保健功能。魏連會等[39]研究發現，相較于鮮荸薺，黑荸薺中增加了一種必需氨基酸——蛋氨酸(Met)和一種還原性氨基酸——半胱氨酸(Cys)，從而使得黑荸薺在營養價值上有所提高。此外，黑荸薺中新增加的揮發性產物——冰片(borneol)使得黑荸薺具有清熱止痛、開竅醒神等功效。

2.6 其他果蔬的加工

除了上述的果蔬種類外，發酵黑化技術還在其他“黑色”果蔬食品的加工過程中有所應用。姬妍茹等[40]將鮮菊芋洗凈，切成3.0 cm左右的厚片，自然晾干后封于耐高溫的塑料袋中進行變溫發酵，制得的黑菊芋色澤黝黑、口感香甜軟彈。但也并不是所有果蔬均可進行發酵黑化，這類果蔬必須要有較高的含糖量，尤其是對還原糖的含量有著較高要求。相關研究發現，以淀粉和蔗糖為主要糖分的馬鈴薯和甜菜，發酵黑化加工后口感不佳；而以果聚糖為主要糖分的菊芋，發酵黑化加工后口感香甜。因此，在選擇發酵黑化原料時，需要準確把握原料中的糖分組成及占比，還原糖的含量對發酵黑化后產品的品質有著重要的影響。

3 發酵黑化技術存在的問題

3.1 蛋白質、礦物質等營養物質的損失

在發酵黑化過程中，果蔬中的蛋白質分解為游離的氨基酸并與羰基化合物發生美拉德反應，而蛋白質作為反應底物不斷被消耗，從而導致蛋白質的損失[41]和營養價值的降低[42]。此外，果蔬中一些重要的礦物質易與美拉德反應物的中間產物發生螯合反應，生成難溶化合物，從而降低食品中礦物質的生物活性，尤其是Ca2+、Mg2+極易與氨基酸結合形成無活性化合物[43]。與此同時，在高溫條件下果蔬中的維生素、花青素等也極易遭受破壞。故此，發酵黑化果蔬存在著蛋白質、礦物質等營養成分損失的問題。而目前對如何解決發酵黑化引起的營養損失的相關研究還較少。在實際生產過程中，可在發酵黑化前適當添加反應底物或發酵黑化結束后添加營養補充劑，以彌補產品因加工生產工藝而造成的營養流失。

3.2 發酵黑化產物的安全性

果蔬在進行發酵黑化時，生成的發酵產物較為復雜，若不對反應進行嚴格控制，還會生成抗營養物質或具有致病性的有毒物質，如丙烯酰胺(acrylamide，AA)[44]、晚期糖基化末端終產物(advanced glycation end products，AGEs)[45-46 ]、呋喃(furans)和5-HMF等。

3.2.1 丙烯酰胺(AA)的生成

在果蔬的發酵黑化過程中，AA的生成主要包括以下3條途徑：葡萄糖和果糖等還原糖與天冬酰胺發生美拉德反應生成Schiff 堿，再分別以Strecker降解途徑和N-糖苷途徑形成AA[47]，且隨著溫度和濕度的增加，其含量也會隨之增加[48]；在酸性高溫的條件下，HMF直接與天冬酰胺發生反應生成 AA[49]；果蔬中單糖在加熱后發生焦糖化反應，產生大量的小分子醛(如甲醛、乙醛等)，進而生成丙烯酸，最終形成 AA[50]。目前，已有研究表明AA對動物具有神經毒性、生殖毒性和致癌性[51]，國際癌癥研究機構(IARC)也將AA列為 2A類致癌物。

對于果蔬發酵黑化過程中AA的調控，可通過調整加工條件和添加抑制劑等措施來抑制AA的產生，如降低熱處理溫度或時間、降低反應pH和添加天然抗氧化劑、外源氨基酸、金屬離子等添加劑[52-58]。此外，項雷文等[59]研究發現，模式美拉德反應產物對AA的量和毒性有削弱作用，這為評估基于美拉德反應加工的食品安全性提供了一個新的視角。

3.2.2 晚期糖基化末端終產物(AGEs)的生成

AGEs是還原糖與氨基化合物通過美拉德反應等途徑生成的一系列結構復雜的化合物的總稱[60]，包括glyoxal derived lysine dimer(GOLD)、methylglyoxal derived lysine dimer(MOLD)、羧甲基賴氨酸(Nε-carboxymethyl-lysine,CML)、羧乙基賴氨酸(Nε-carboxyethyl-lysine,CEL)、戊糖素(pentosidine，PTD)和吡咯素(pyrraline)等[61]。Uribarri等[62]研究發現，糖尿病、阿爾茨海默癥等疾病的發生均與AGEs 的蓄積有密切聯系。

對此，可利用天然提取物來抑制果蔬發酵黑化過程中AGEs的產生和積蓄，Sampath等[63]研究發現根皮素(phloretin)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、3-沒食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate，EGCG)和6-姜辣素(6-gingerol)在細胞和動物體內對AGEs積蓄均有很好的抑制效果；李書藝等[64]也研究了荔枝果皮原花青素(litchi pericarp procyanidins，LPPC)對AGEs的抑制作用，發現LPPC對AGEs的抑制率顯著高于維生素C(Vc)和氨基胍(aminoguanidine)，可將其作為一種新的AGEs天然抑制劑進行深度開發。

3.2.3 呋喃的生成

在高溫高濕條件下，果蔬中的碳水化合物易發生熱降解和重排，從而生成大量呋喃類化合物，如絲氨酸、蘇氨酸和蔗糖在高溫下生成的產物中就可檢出350多種呋喃化合物[65]。Elif等[66]通過臨床老鼠實驗和形態計量學統計，發現呋喃化合物會對老鼠上皮高度和生殖器官官腔直徑產生影響，這些現象表明呋喃對雄性生殖系統有毒害作用。雖然還沒有直接研究發現呋喃會對人體造成相同的危害，但這也足以引起人們的重視和警覺[67]。

在果蔬發酵黑化加工生產中，可適量添加一些抑制呋喃生成的化合物，如天然活性物質、抗氧化劑等[68]。張璐[69]研究發現茶多酚對葡萄糖-丙氨酸模型中呋喃的生成具有顯著抑制作用；吳思佳[70]通過毒理學實驗和葡萄糖-丙氨酸低濕體系篩選了5種天然植物源成分，其中和厚樸酚(honokiol，HNK)對呋喃抑制效果最佳，且對由呋喃引起的小鼠肝、腎損傷有一定的保護作用；畢可海[71]利用美拉德溶液模擬體系研究發現抗氧化劑可與葡萄糖結合，從而抑制了葡萄糖與丙氨酸之間美拉德反應的發生，進而影響中間產物果糖胺的生成，最終抑制呋喃的產生。

3.2.4 五羥甲基糠醛(5-HMF)的生成

目前，國內外研究學者對于美拉德反應產物中5-HMF的安全性還存在爭議，在5-HMF的體內、外安全性研究實驗中，所得結論也并不一致。在體外實驗中，5-HMF易轉化為 5-亞磺酰甲基糠醛(5-sulfoxymethylfurfura ，5-SMF)，其遺傳毒性結果顯示為陽性[72]，Glatt等[73]研究發現5-HMF對細菌和哺乳動物細胞具有損傷基因及誘發突變的效應，其機理是與細胞核中的DNA、RNA和蛋白質等重要物質發生相互作用，由此可能會對這些大分子物質造成結構性損傷，從而具有致毒性和致突變性。但在體內實驗中5-HMF的遺傳毒性結果顯示為陰性72，Durling等[74]通過彗星試驗發現，只有在加入硫酸轉移酶(sulfotransferase，SULT)后，高劑量下5-HMF對人Caco-2、HEK293細胞，小鼠L5178Y細胞和中國倉鼠V79、V79-hP-PST(高表達人SULT活性) 細胞才會導致顯著的DNA損傷。因此，機體內在無SULT的情況下，5-HMF無法表達遺傳毒性[75]，但其存在的潛在風險也足以引起人們的重視。

因此，為保證發酵黑化果蔬產品的安全性，需對產品中5-HMF的含量進行嚴格控制。目前，緩解食品中5-HMF生成的主要途徑有減少反應前體物質和添加外源化合物[76]，而添加外源化合物在果蔬發酵黑化加工中是最為直接有效的方法。研究發現，綠原酸(chlorogenic acid)[77]、沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)和表兒茶素(epicatechin，EC)對HMF的生成均有較好的抑制效果[78-80]；此外，阿魏酸(ferulic acid)、兒茶素(catechins)和原花青素(procyanidins，PC)等天然抗氧化劑對HMF的抑制作用也在不斷探索中，利用天然化合物抑制發酵黑化過程中HMF的產生也將是下一步的研究重點。

4 結論與展望

隨著對美拉德反應的深入研究，美拉德反應不僅被用于香辛料和煙草增香劑的生產，在發酵黑化果蔬產品的生產中也被廣泛應用。特別是隨著對發酵黑蒜研究的深入，發酵黑化技術在黑蒜的生產實踐中已變得較為成熟，黑蒜也是目前最為常見的發酵黑化果蔬產品。近年來，國內外對其他果蔬的發酵黑化研究也越來越多，如發酵黑化紅棗、洋蔥、枸杞等，這表明發酵黑化技術在果蔬深加工產品的生產中已取得顯著階段性成果和實際性研究進展。

發酵黑化在果蔬加工中的興起為我國果蔬加工業提供了一條全新的加工思路，豐富了我國果蔬深加工產品的種類，對整個果蔬產業的發展也起到一定的刺激作用。此外，發酵黑化技術賦予了果蔬產品獨特的功能性，其抗氧化能力得到較大提升，也為保健食品的開發提供了新的思路。雖然我國對發酵黑化果蔬的研究起步較晚，在實際生產中還存在部分問題，尤其是對于果蔬發酵黑化過程中發酵產物的風險性和安全性的控制。但隨著對發酵黑化技術的深入研究和不斷完善，發酵黑化果蔬的加工技術變得越發成熟，發酵黑化果蔬產品也受到了越來越多消費者的關注，這對發酵黑化技術在果蔬加工中的應用和推廣有著重要意義。