褐藻降血糖活性物質的研究進展

袁鑫，閆培生

（哈爾濱工業大學（威海）海洋科學與技術學院，山東 威海 264209）

高血糖（hyperglycemia）是一種慢性疾病，發生在胰腺不再能夠制造胰島素或人體無法充分利用其產生的胰島素時，會導致血液中葡萄糖水平升高。在中國已有1.14億的患病人數，6 130萬的未診斷人數以及4 680萬的前期患者[1]。糖尿病患者糖基化產物的積累和伴隨的結構性細胞外基質修飾導致了糖尿病功能性并發癥的發展，包括心血管疾病、腎病、眼部疾病等，大大增加了其死亡率[2]。目前，有效的降血糖藥物包括二甲雙胍、格列美脲、阿卡波糖、諾和靈30R、優泌林70/30等，這些藥物雖然有效，但長期使用依然會產生相應的繼發癥，如庫欣綜合征、肢端肥大癥等[3]。因此開發天然、無副作用的新型藥物迫在眉睫。隨著我國海洋強國的提出，現在進入了大規模開發利用海洋時期，期望從海洋中找到新的降血糖藥物，對海藻降血糖活性物質的研究由來已久，尤其是褐藻，由于其種類豐富、結構新穎已成為開發降血糖藥物的重要來源。

1 褐藻降血糖活性物質的種類

褐藻是海洋藻類中較高級的多細胞生物，主要指海帶、裙帶菜、馬尾藻、鹿角菜等，近年來，隨著對褐藻有效成分的分離與鑒定，證明了其降血糖活性物質的多樣性。

1.1 多糖類

褐藻多糖是一類分子量大、結構復雜、具有其它多糖不具有的藥理活性的天然化合物，目前主要是從海帶、墨角藻等中提取，以褐藻膠和褐藻糖膠形式存在[4]。徐宏亮通過對鏈脲佐菌素導致的糖尿病小鼠模型發現，每天喂食來自墨角藻的褐藻多糖500 mg/kg，發現其對糖尿病小鼠的血糖有顯著抑制作用，在喂食第21天后，血糖含量降低了11.3%，在第32天，下降了21.1%，并發現其可能通過調節血糖代謝或抗氧化等方面，顯著降低血糖含量，但其并未對褐藻多糖進行純化鑒定，沒有明確其有效成分[5]。王晶等通過對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠發現，褐藻多糖硫酸酯對糖尿病小鼠的體重和糖耐量沒有顯著影響，卻可提高血清胰島素水平，并通過摘除右腎后注射鏈脲佐菌素致患糖尿病小鼠模型研究發現，模型組小鼠的白內障患病幾率低于空白組，且尿蛋白含量減少，在給藥第8周、10周血糖明顯下降，推測其可能是通過提高血清胰島素水平，降低血糖含量[6]。徐穎婕通過對鏈脲佐菌素導致的糖尿病小鼠模型發現，低分子量褐藻多糖硫酸酯（8 177 Da），以低劑量 100 mg/kg、高劑量 200 mg/kg給模型小鼠灌胃，高劑量效果好于低劑量組，都可以減輕蛋白尿的發生，其糖化血清蛋白高劑量組第69天時的含量為（219.9±58.1）mmol/L，低于模型組小鼠的（279.2±41.6）mmol/L，可通過抑制乙酰肝素酶及相關生長因子的表達，來減輕腎病并降低血糖含量緩解糖尿病[7]。Heeba等通過喂食高脂飲食12周的小鼠模型，在第4周開始口服巖藻依聚糖（100 mg/kg），結果顯示，其可減緩非酒精性脂肪肝的發展，降低空腹血糖含量及對胰島素的抵抗，有效降低了血脂含量[8]。Kim等通過對巖藻依聚糖的結構研究發現，較低的硫酸鹽含量（15.5%）和中等分子量（2 351 kDa）的巖藻依聚糖可以通過與α-淀粉酶靜電結合而抑制其活性，從而發揮對2型糖尿病的治療[9]。海藻酸鈉主要是從馬尾藻、海帶等褐藻中提取到的，由β-D-甘露糖醛酸（M糖），和α-L-古洛糖醛酸（G糖）連接而成的鈉鹽，其具有降血糖、抗氧化等功能。Sim Sung-Yi等從裙帶菜中提取褐藻多糖，將3T3-L1細胞（小鼠成纖維細胞）分別用10、50、100、200 μg/mL 處理，通過 AdipoRed分析脂肪細胞分化過程中的脂質積累，發現其活性呈劑量關系抑制3-磷酸甘油脫氫酶（glycerol 3-phosphate dehydrogenase，GDPH）的活性，改善胰島素刺激的葡萄糖攝取和抑制脂肪細胞中的基礎脂解，以達到抗糖尿病的功效[10]。

1.2 寡糖類

衍生自海藻細胞壁的寡糖具有多種生物活性，也已成為降血糖藥物的重要來源。祝君梅等通過四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的研究，利用從高等褐藻細胞壁中提取到的殼聚糖的降解產物殼寡糖以600、300、150 mg/kg喂食模型組小鼠21 d，發現其給藥后的胰島素水平均升高，分別為（39.41±17.2）、（31.14±7.91）、（30.46±11.03）mmol/L， 高于模型組的胰島素水平（27.95±1.79）mmol/L，對正常小鼠的血糖含量無影響，可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平，其作用機理為增強胰島素受體的敏感性，以達到降血糖的作用[11]。張敖珍等通過四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的研究，喂食硒化卡拉膠寡糖（硒含量1.125%）高、中、低3個劑量組的模型小鼠，其中中、小劑量組的血糖含量與正常小鼠的無顯著變化，均在（5.78±1.85）mmol/L，而高劑量組的血糖含量明顯降低，其值為（4.59±0.89）mmol/L，但其作用機理目前尚不明確[12]。

1.3 生物肽

多種氨基酸以不同排列方式組成肽，而肽又是組成大分子蛋白質的前提。蛋白質組學領域的發展為解決糖尿病等健康問題提供了有前途的解決方案。功能肽通常是在體內或體外條件下存在，使用不同種類的蛋白水解酶通過酶促水解從蛋白質中產生的，具有多種活性，包括抗糖尿病和免疫調節[13-14]。孟然研究發現海帶酶解物（蛋白質含量為30.56%）對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具有抑制作用，其IC50值分別為8.24 mg/mL、16.76 mg/mL，且抑制作用與劑量濃度呈正相關[15]。糖尿病會引起機體抗氧化能力的下降，因此，提高抗氧化能力會從側面有效的緩解糖尿病以提高機體氧化應激能力。黃欽欽等通過酶解條斑紫菜獲得以1 000 Da以下二肽到五肽為主的小分子活性肽蛋白酶解液，并解析出兩條多肽的氨基酸序列，分別為丙氨酸-脯氨酸（Ala-Pro）、脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸（Pro-Gly-Gly-Val），測出 1 000 Da以下粗肽液對α-葡萄糖苷酶的IC50為19.83 μg/mL，低于阿卡波糖的IC50值 35.65 μg/mL，具有明顯的降血糖功能[16]。

1.4 膳食纖維

膳食纖維被定義為“凡是不能被人體內源酶消化吸收的可食用植物細胞、多糖、木質素以及相關物質的總和”，海藻中含有豐富的膳食纖維，馬尾藻、江蘺等均是其來源[17]。湯宇青等將石莼脫蛋白處理后得到水溶性膳食纖維，測定其對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性均高于未脫蛋白前，其最大抑制率分別為43.90%、63.02%，并具有明顯的量效關系[18]。李耀冬等通過對四氧嘧啶糖尿病小鼠模型灌胃高、中、低劑量組的復方海藻膳食纖維混懸液，并測量模型小鼠的空腹血糖含量，結果表明高、中、低劑量組的血糖含量均低于正常小鼠的血糖（21.52±2.55）mmol/mL，且存在明顯的劑量關系，證實海藻膳食纖維可有效的降低模型小鼠的血糖水平并減輕胰島β細胞受損程度[19]。Isabel等通過研究健康志愿者餐后血糖反應，先采集禁食狀態下的血糖含量，再測量食用海苔15、30、45、60、90、120 min時的血樣分析表明，攝入富含膳食纖維的海苔面包后，在30 min～60 min時發現了葡萄糖粒，葡萄糖水平持續到120 min，以此計算淀粉消化率做為預測血糖含量的指標，其作用機制可能是通過改變面包中淀粉的生物利用度，促進淀粉的消化以降低血糖水平[20]。Mojica等通過比較裙帶菜、長卷心菜、紫菜的氯仿、乙醇和水溶液提取物對α-葡萄糖苷酶和葡萄糖擴散的體外抑制活性表明，可溶性膳食纖維對降血糖具有有效作用[21]。肖紅波等通過給四氧嘧啶糖尿病小鼠喂食高、低劑量組的可溶性裙帶菜膳食纖維，測定其血糖，發現其對正常小鼠的血糖含量無明顯影響，其血糖含量均在（8.55±1.13）mmol/L，但對模型組小鼠的血糖含量有顯著降低，高、低劑量組模型小鼠的糖異生率為7.8%、5.6%，作用機制可能為降低了四氧嘧啶對胰島β細胞的損傷或改善了受損傷胰島β細胞的功能，以達到降血糖的功效[22]。

1.5 酚類

海藻多酚是海藻次級代謝產物，隨著提取和分離純化技術的改進，人們對其生物活性有了更深的了解，其在降血糖新藥開發的作用越來越重要。海藻多酚具有很強的自由基清除性能，因此具有較強的抗氧化能力。Spurr等發現水和乙醇-水的混合物是大規模從海藻中提取間苯二酚最適合的溶劑[23]。Seung-Hong Lee等從褐藻Ecklonia cava中提取到一種鄰苯二酚的生物多酚化合物，以80名糖尿病前期的男性和女性成年人為研究對象，分為平行分組設計的隨機、雙盲和安慰劑對照試驗，記錄血糖參數、血清生化和血液學的影響，發現其可保護細胞免受高血糖引起的氧化應激所造成的傷害，也可對2型糖尿病患者的肝糖和脂質代謝具有有益作用[24]。Hyun-Ah Lee等從褐藻Ecklonia cava中分離到一種間苯三酚，以鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠為模型，喂食后在0、30、60、120 min從尾靜脈采血，并通過血糖儀測量血糖，并以阿卡波糖為陽性對照，測定其對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性，發現其IC50分別為23.35、6.94 mg/mL，而且該酚還可延遲碳水化合物的消化和在小腸中的吸收，從而降低了餐后血糖水平[25]。

2 褐藻降血糖活性的檢測方法

2.1 動物模型

在驗證提取物降血糖功能時，通常使用四氧嘧啶和鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型。其原理是：四氧嘧啶是有毒的葡萄糖類似物，其優先通過葡萄糖轉運蛋白積累在胰腺β細胞中，在細胞內硫醇（尤其是谷胱甘肽）存在的條件下，四氧嘧啶在循環氧化還原反應中會與其還原產物二乙酸產生活性氧，并與鐵催化反應步驟中產生羥自由基，這些羥自由基導致β細胞的死亡，并最終導致胰島素依賴性“四氧嘧啶糖尿病”。鏈脲佐菌素分為葡萄糖和甲基亞甲基脲部分，由于其烷基化特性，后者可以修飾生物大分子，使DNA斷裂并破壞β細胞，從而導致胰島素依賴狀態[26]。而在高血糖小鼠模型的建立上也要注重模型的穩定性和成模率。朱之烽等通過正交試驗，確定了在第3周開始注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），注射劑量為85 mg/kg（注射2次，每次間隔5 d），成模率在90%以上，使其更接近2型糖尿病[27]。

2.2 分子模型

因為目前普遍的降血糖藥物（阿卡波糖、格列寧）均是α-葡萄糖苷酶抑制劑，所以提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是一個降血糖效果的指標。α-糖苷酶抑制劑不像胰島素或磺酰脲類具有降血糖活性，相反，在攝入碳水化合物后降低健康和糖尿病個體的餐后血糖升高，減少餐后胰島素分泌，其減少了極低密度脂蛋白的合成，并且與胰島素和磺酰脲類藥物相比，沒有脂肪形成潛力[28]。其酶促反應體系如下：以阿卡波糖為陽性對照，等量的緩沖液為陰性對照，樣品液先通過微孔膜過濾，將α-葡萄糖苷酶與各濃度梯度的樣品溶液充分混合，然后經過保育，再加入適量的對硝基苯-α-D-葡萄糖苷（P-Nitrobenzene-α-D-glucoside，PNPG），最后再加入終止劑，在405 nm波長下測定吸光度（OD）值，其抑制率公式為：

抑制率/%=（1-樣品組OD值/陰性對照組OD值）×100

同時蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）是開發治療糖尿病藥物的有效靶點之一，PTP1B是胰島素信號通路的重要調節劑，其可使胰島素受體激酶的絡氨酸殘基去磷酸化來負調控胰島素信號的傳導，因此PTP1B是治療2型糖尿病的誘人靶標[29]。

3 褐藻降血糖活性物質的提取方法

3.1 多糖類的提取

褐藻多糖提取多以成本低且操作簡單的稀酸、稀堿和水提法居多，隨著近些年來微波、超聲、酶解法的發展，人們對其提取工藝的研究越加深入。戴圣佳等通過單因素和正交試驗優化了海藻多糖硫酸酯的超聲提取工藝，確定了最佳提取條件：超聲功率250 W、超聲時間 25 min、料液比 1 ∶70（g/mL）、溫度 60 ℃[30]。譚潔怡等進行了超聲波法提取裙帶菜中褐藻多糖硫酸酯的提取工藝優化，確定了最佳提取條件：固液比1∶100（g/mL）、超聲功率 1 000 W、超聲時間 25 min，該條件下的褐藻多糖硫酸酯的得率和純度比水提法提高了23.59%、30.92%[31]。Rosa等進行了微波法提取巖藻依聚糖的提取工藝優化，確定了最佳提取條件：在壓力 827.4 kPa、萃取時間 1 min、料液比 1 ∶25（g/mL）時，巖藻依聚糖的收率最高為18.22%[32]。Noelia等對超聲法提取鼠尾藻中的巖藻依聚糖的工藝進行了優化，確定了最佳提取條件：溫度25℃、超聲功率150 W、頻率40 kHz、時間5 min～30 min，在最佳條件下提取到的產物：質量比為 1∶0.70∶0.33∶0.27∶0.22∶0.10 的巖藻糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：鼠李糖的寡糖，超聲提取裙帶菜可提高收率并減少提取時間，而且比標準巖藻依聚糖（767.2 kDa）和常規巖藻依聚糖（582.5 kDa）相比，平均相對分子質量降低了（390.6 kDa）[33]。Quitain 等進行了微波-水提法對裙帶菜中提取褐藻糖膠的工藝研究，結果表明，與常規加熱相比，微波加熱更具優勢，可以在接近140℃的溫度下獲得5 kDa～30 kDa的低分子量組分，在恒定的微波功率下，在短短的1min照射時間內連續進行微波照射，就可獲得理想結果，并且在水熱加熱的微波照射過程中，由于分子攪拌，局部加熱和傳質的改善等熱效應，褐藻糖膠的降解得到增強[34]。

3.2 褐藻寡糖的提取

傳統的褐藻寡糖多是用濃酸水解海藻酸鈉，但伴隨著嚴重污染和聚合度難以控制等問題，隨著酶解法、氧化降解法等的提出，大大解決了該問題。賀秋紅等利用響應面法優化了海藻寡糖的提取工藝，最佳條件為：海藻酸鈉質量濃度1 g/100 mL、酶解溫度40℃、pH8.0，得到的寡糖的平均聚合度為4.08，比優化前降低了27.35%[35]。李海波等采用氧化降解技術從馬尾藻等藻類中提取海藻膠低聚寡糖的工藝進行了優化，最佳條件為：氧化劑（H2O2）濃度6%、反應時間8 h，其產率達到最高60%左右[36]。Hyun-Jee Kim等從褐藻Sargassum Thunbergii中提取了一種可降解藻酸鹽的細菌，通過16 S rRNA序列分析其為弧菌屬菌株，可在pH為7、3% NaCl和6%海藻酸、孵育48 h，經過薄層色譜分析結果表明，其可用于藻酸鹽寡糖的制備[37]。

3.3 膳食纖維的提取

褐藻中含有大量的半纖維素和纖維素，是膳食纖維的重要來源。費亞芬等從7種海藻中篩選出龍須菜的膳食纖維含量最豐富，其含量為67.17%，并用響應面優化了殘渣膳食纖維的提取工藝，最佳條件為：料液比 1∶95（g/mL）、時間 50 min、溫度 50℃、功率 200 W，此條件的實際得率為8.23%[38]。呂鐘鐘通過單因素試驗，確定了木瓜蛋白酶酶解蛋白質的最佳工藝，其條件為：pH6.5、溫度50℃、酶量0.5%、酶解時間2 h[39]。李來好等通過酶-化學相結合的方法優化了海帶膳食纖維的提取工藝，其最佳條件為：纖維素酶含量100U/g、蛋白酶2 000 U/g、時間1 h，其產率可達到27.1%[40]。

3.4 多酚類的提取

國內外有關多酚的提取方法主要有：水和有機溶劑提取法、離子沉淀法、超聲波浸提法、低溫純化酶法、超臨界萃取等方法[41]。從海藻中分離得到的多酚主要為褐藻多酚類、黃酮類、酚酸類和鹵代酚類等。婁燕通過單因素試驗和響應面法優化了從鼠尾藻中提取多酚的工藝，其最佳條件為：料液比為1∶25（g/mL）、乙醇濃度為40.2%、浸提時間40 min，其鼠尾藻多酚的理論浸出率為1.704%，實測為1.703%[42]。Minseok Yoon等通過響應面法優化了從褐藻Ecklonia cava中回收蘆丁單寧的提取條件，其最佳條件為：乙醇濃度為95%、提取溫度80℃、提取時間24 h，在此條件下，提取出的總蘆丁單寧為57.2 mg，間苯三酚的收率為7.8%[43]。Michalak等從滸苔中提取多酚，確定了最適實驗條件為：時間8 h和100 μL纖維素酶的水解產率為36%，每100g干提取物的總酚含量為55mg沒食子酸當量[44]。K.H.Sabeena等用體外抗氧化劑測定法篩選了16種來自丹麥海岸的海藻的水和乙醇提取物的抗氧化活性，發現乙醇比水更有效的萃取多酚，通常，各種抗氧化測定與總酚含量相關性很好，說明藻類多酚是這些提取物的活性成分。但是，在某些抗氧化劑測定中，總酚含量較低的某些物種也顯示出良好的抗氧化功能，表明乙醇提取物中的其他成分如硫酸化多糖、蛋白質等也具有抗氧化活性[45]。

4 展望

糖尿病已經成為人類健康的一大殺手，而目前的降血糖藥物大多數是化學合成的，雖能有效的抑制高血糖，但隨著用藥的增加和身體狀況的變化，都會產生許多副作用，因此，海洋藥物是人類的一個重要選擇。海藻尤其是褐藻具有多種降血糖活性物質，然而目前對其缺乏有效的提取手段，且大多數均利用化學方法提取，這無疑增加了提取成本。褐藻降血糖活性物質的結構鑒定、構效關系與作用機制也尚不明確。隨著組學的發展，將此利用在降血糖海洋藥物的開發上顯得勢在必行。