組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）對小麥基因編輯效率的影響及轉錄組學分析

代文雙 劉會云 杜慶國 鄒棖 王軻

（中國農業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081）

作為重要的糧食作物，小麥在世界各地被廣泛種植。我國作為世界上最大的小麥生產國和消費國，其生產對保障糧食安全有重要的現實和戰(zhàn)略意義。小麥的增產和品質改良愈發(fā)重要，產量和品質等重要性狀都是受多基因和環(huán)境互作的復雜性狀，單純靠常規(guī)育種技術很難滿足需求，基因編輯技術是改善這一現狀的有效手段。基因組編輯技術的發(fā)展和應用為植物功能基因研究和作物遺傳改良提供了重要的技術支持。與其他基因組編輯技術相比，近年來誕生的CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas）系統(tǒng)（主要包括CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a）具有操作簡單、效率高的優(yōu)點。自2013年CRISPR/Cas9首次應用于真核生物［1-2］，即成為生命科學領域的革命性工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已成功地用于各種真核生物的基因組工程中，并為基因治療和植物育種提供了強大的工具［3］。目前，CRISPR/Cas9在植物基因組編輯中的應用主要包括基因功能研究和作物遺傳改良。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率在不同物種間差異很大，而且對于單倍體和多倍體植物來說該技術的難度也存在顯著差異［4-5］。比如二倍體植物水稻CRISPR/Cas9技術產生突變的效率可達到80%以上［6］。多倍體植物尤其是小麥、馬鈴薯等，構建有效的基因編輯系統(tǒng)仍然是當前研究的難點［7-8］。小麥是由A，B和D三個基因組組成的六倍體，基因組約17 Gb，約為水稻的40倍［9-12］，且重復序列高達85%-90%［13-14］。利用CRISPR/Cas9技術同時編輯小麥基因組中的多個拷貝依然非常困難，這是限制小麥基因編輯應用的主要原因。雖然在小麥中TaWaxy基因編輯效率高達80%，但3個同源基因同時編輯的效率僅有30%左右［15］。因此，提高小麥尤其是3個基因組的編輯效率的研究工作至關重要。

真核生物染色質結構會影響CRISPR/Cas9基因編輯效率。在真核細胞中細胞核DNA以約147 bp的DNA繞八聚結構的組蛋白1.67圈，進而形成核小體［16-17］。相鄰核小體的連接區(qū)由10-80 bp的游離DNA與組蛋白H1共同構成，此串聯結構進一步折疊、凝聚形成染色質［18］。核小體（染色質的基本結構單位）的存在會阻礙Cas9蛋白對其纏繞DNA上的靶點的連接與切割，降低編輯效率［19-21］。染色質主要以開放和非開放兩種狀態(tài)存在。核小體與DNA纏繞致密、染色質緊實度高的區(qū)域為非開放區(qū)，反之即為染色質開放區(qū)。開放區(qū)域染色質狀態(tài)相對松散，該區(qū)域內的基因組占總DNA序列的2%-3%，且超過90%的開放區(qū)域與轉錄因子的結合相關［22］。Wu等對哺乳動物Cas9的結合位點進行了全基因組作圖，發(fā)現Cas9蛋白與靶基因的作用主要集中在染色質開放區(qū)域［23-24］。Chari等［25］在對人類細胞研究中也發(fā)現CRISPR/Cas9誘導的插入與缺失在染色質開放區(qū)域更多。除在動物中，在植物的研究中也發(fā)現這一現象，結合已有的基因組數據信息在水稻開放區(qū)域的CRISPR/Cas9編輯效率要高于非開放區(qū)域［26］。

研究人員可以通過改變染色質局部結構調控染色質的開放與非開放狀態(tài)來提高CRISPR/Cas9對基因組的編輯效率。Isaac等［27］利用兩種染色質重塑 因 子SNF 2h（Sucrose non-fementing 2h）和RSC（Remodels the structure of chromatin）增加開放染色質區(qū)域，進而顯著提高了Cas9蛋白靶向DNA能力。HMGN（High mobility group proteins）、HMGB1（High mobility group box 1 protein）組蛋白H1和染色質重塑復合物等是能與蛋白質自然構象相互作用的蛋白質。其中HMGN蛋白是核小體連接蛋白，可以調節(jié)染色質結構［28-30］；HMGB1具有DNA彎曲活性，并且與組蛋白H1競爭核小體附近的染色質［31-33］。一種名為CRISPR-chrom的方法［34］，通過將Cas9直系同源物與這些染色質調節(jié)相關的多肽融合在一起，能顯著提高Cas9的編輯效率。簡單來說，這些方法都是通過重塑染色質，即調整或移除核小體、調節(jié)組蛋白等來提高Cas9對靶點的編輯效率。

組蛋白乙酰化在核小體重塑中起主要作用［35-36］。它是研究最早，特征最多的翻譯后修飾［37］。組蛋白乙酰化修飾可以改變染色質結構，調控基因轉錄、DNA復制和修復［38-39］。組蛋白乙酰化的賴氨酸可被重塑因子SWI2/SNF2（Switching defective2/sucrose non-fermenting2）識別和結合進行染色質重塑［40］。其修飾水平受組蛋白乙酰化轉移酶（Histone acetyltransferases，HAT）和組蛋白去乙酰化轉移酶（Histone deacetylases，HDAC）的調節(jié)，其中組蛋白去乙酰化轉移酶在植物的生長、發(fā)育和響應脅迫方面發(fā)揮重要作用［41-44］。

丁酸鈉（Sodium butyrate）和尼克酰胺（Nicotinamide）是常見的用來研究組蛋白乙酰化修飾水平的兩種組蛋白去乙酰化酶抑制劑（Histone deacetylase inhibitors，HDACi）。丁酸鈉是一種短鏈脂肪酸，可抑制RPD3/HDA1 HDAC基因家族的同源物［45］。尼克酰胺是維生素B3的衍生物，屬于SIR2類的 HDAC去乙酰化酶抑制劑，當過量加入會顯著抑制哺乳動物和酵母中HDAC［46-47］。尼克酰胺處理會抑制擬南芥產生SIR2類的HDAC（SRT1和SRT2），導致染色質重塑蛋白VIN3（Vernalization Insensitive 3）位點的表達量升高［48-49］，進而抑制FLC（Flowering Locus C）的表達。FLC水平的升高會抑制開花，即尼克酰胺處理對FLC的抑制作用可促進開花［49-51］。在玉米中也有HDACi的應用，Tiricz等［52］用丁酸鈉和尼克酰胺處理玉米細胞，可以促進染色質區(qū)域松散狀態(tài)，而且能夠提高寡核苷酸 定 向 誘 變（Oligonucleotide-directed mutagenesis，ODM）的效率，即提高ODM類基因編輯效率。

本研究主要利用組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理小麥幼苗，通過對小麥幼苗的生長及轉錄組學分析，發(fā)現了6個甲基轉移酶合成通路基因下調表達都與染色體開放狀態(tài)相關，從而發(fā)現尼克酰胺處理會改變小麥染色質狀態(tài)及基因表達；我們進一步以對未發(fā)生編輯的TaAGO4a基因編輯轉基因小麥材料的T1代為材料，取其開花14 d的幼胚進行一步成苗并利用尼克酰胺處理T2代幼苗，結果顯示尼克酰胺確實可以增加小麥TaAGO4a基因編輯效率。這為提高小麥基因編輯效率提供一種新策略，為進一步研究小麥CRISPR/Cas9系統(tǒng)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

轉錄組測序所用材料為六倍體小麥春性品種Fielder，以含有SpCas9和針對TaAGO4a基因的sgRNA且未發(fā)生編輯的Fielder的T1代轉基因植株為材料研究尼克酰胺與編輯效率之間關系的實驗。由中國農業(yè)科學院作物科學研究所轉基因中心小麥遺傳轉化實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng) 選取大小一致、飽滿的小麥種子生長于溫室中，日照16 h，24℃；黑暗8 h，18℃。培養(yǎng)條件為光強300 μmol/m2/s，濕度為45%，每周澆水一次。選取開花授粉后14 d左右未成熟的小麥籽粒，用70%的乙醇洗1 min，然后用15%的次氯酸鈉震蕩洗滌10 min，最后用無菌水洗3次。于超凈工作臺中無菌操作分離小麥幼胚，將小麥幼胚的胚軸朝上放置于1/2 MS（2.215 g MS/L 粉末，20 g/L蔗糖，0.5 g/L MES，3 g/L 植物凝膠，pH 5.8）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別設置濃度為0 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L的尼克酰胺培養(yǎng)基和0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L的丁酸鈉6種培養(yǎng)基。長日照培養(yǎng)（16 h光照/8 h 黑暗）室溫25℃，光強300 μmol/m2/s。

1.2.2 生理指標測定及樣品選取 記錄尼克酰胺和丁酸鈉兩種試劑不同濃度處理的小麥幼苗長勢，記錄生長7 d、14 d時小麥幼苗的株高與生長狀況。對3種濃度尼克酰胺處理的小麥幼苗，每種材料取3個重復，蒸餾水沖洗3-4次，吸干表面水分，液氮速凍，置于-80℃暫存。取T1代轉基因植株的幼苗葉組織約0.1 g提DNA，確認這批材料是含未被編輯的TaAGO4a基因且Cas9/sgRNA編輯復合體仍然存在的植株。對上述材料繼續(xù)培養(yǎng)并摘取其幼胚進行尼克酰胺處理，并對處理7 d和14 d的T2代幼苗葉組織取約0.1g提DNA，檢測植株編輯情況。

1.2.3 轉錄組測序 利用TransZolUp（TransGen Biotech，USA）提取不同濃度的尼克酰胺（0 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L）處理7 d和14 d葉組織的總RNA，實驗設置兩個重復共12個樣本，分別記做ctrl7d_1，ctrl7d_2，t7d-2.5_1，t7d-2.5_2，t7d-5_1，t7d-5_2，ctrl14d_1，ctrl14d_2，t14d-2.5_1，t14d-2.5_2，t14d-5_1，t14d-5_2。將這些RNA去除基因組DNA后，檢測RNA樣本的濃度與完整性，濃度均＞ 800 ng/μL，RIN ＞ 7（RNA完整性，大于7既滿足建庫要求，大于6.3可以獲得較高的mapping率），OD260/280＞ 1.8，RNA質量檢測合格，即可送北京貝瑞和康生物技術有限公司進行RNA-seq高通量測序。

1.2.4 數據分析 利用Trimmomatic軟件［53］對這24個文庫Raw Reads去除測序接頭、低質量Reads、未知堿基比例大于5%的Reads以及接頭污染的Reads，得到Clean Reads。利用FastQC軟件對Clean Reads進行質控，通常Q30（堿基測序錯誤率小于0.1%）的堿基數占總堿基數的85%以上，才認為數據符合分析要求。利用Hisat2 v2.1.0［54-55］將過濾合格的Clean Reads比對到小麥RefSeq v1.0［12］參考基因組上，雙端比對的最大片段長度設為400 bp，其他參數選用默認參數，比對結果存儲于Sam（Sequence alignment map）文件中。用Samtools軟件把Sam轉為Bam（Binary alignment map）格式文件，參數采用-sort -@ 8。然后利用Stringtie v1.3.3［55-56］軟件組裝、拼接轉錄本，參數使用-B -G。輸出文件用R語言中的Ballgown包來計算基因表達量，結果以FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped，每千堿基外顯子百萬片段數）表示基因的表達水平。Htseq-count v0.8.0［57］軟件用以計數bam文件中的reads數。差異表達分析選用R包DEseq2，輸入文件正是上述Htseq-count的輸出文件。其中FKPM ＞ 1被定義為“表達基因”，否則認為基因非表達。矯正P值＜ 0.05及差異變化倍數（|Log2 Fold Change|，LFC）≥ 2被定義為差異表達基因。

1.2.5 GO富集與pathway分析 差異表達基因的GO富集分析利用R語言中的clusterProfiler包完成。小麥RefSeq v1.0參考基因組基因的GO注釋以及GO號的注釋下載自：EnsemblePlants（http：//plants.ensembl.org/index.html），pAdjustMethod：”BH”。獲得的主要基因利用Plant reactome（https：//plantreactome.gramene.org/index.php?lang=en）網站進行pathway富集分析。

1.2.6 T1代陽性轉基因植株鑒定 對T1代未發(fā)生編輯的QA147-1，QA167-2和QA167-7三個株系的TaAGO4a基因編輯材料幼苗進行不同濃度的尼克酰胺處理，在處理7 d時取樣，然后處理14 d時再次進行取樣，對取得的樣品用DNA提取試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）從植株葉片中提取基因組DNA，并用barF（ACCATCGTCAACCACTACATCG）和barR（GCTGCCAGAAACCACGTCATG）引 物 對bar基因進行PCR檢測，反應程序為95℃預變性10 min；95℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴增25個循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，篩選陽性轉基因植株。

1.2.7 T1代和T2代轉基因植株突變類型檢測 首先利用TaAGO4a基因的通用引物AGO4a486F和AGO4a1404R對陽性的TaAGO4a基因編輯轉基因材料進行聚合酶鏈式反應-限制性內切酶圖譜分析（PCR-RE）檢測突變類型。PCR-RE具體步驟是首先利用普通2×Taq MasterMix，擴增陽性轉基因植株的靶點序列（GCACACGCAAGAAGCCATTC），然后對擴增產物用相應的限制性內切酶XmnI酶切2 h，最后用濃度為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，根據酶切片段的大小和數目判斷轉基因植株的編輯類型。然后對于編輯植株進一步利用3A，3B和3D三個基因組的特異性引物進行PCR-PE實驗，其中3A基因組特異性引物為AGO4a486F和Ago4aA1629R；3B基因組為Ago4aB749F和AGO4a1404R；3D基因組為Ago4aD698F和AGO4a1404R，并對酶切后的PCR產物送由北京擎科生物科技有限公司進行突變體測序，所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列表

2 結果

2.1 組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）對小麥幼苗生長的影響

丁酸鈉處理的小麥幼苗在7 d和14 d時幾乎都不能生長（圖1-A），丁酸鈉嚴重抑制小麥的生長，因此不適合用于小麥幼苗的處理。尼克酰胺處理在初期（7 d內），小麥幼苗生長落后于野生型對照組，但差異不顯著。而且2.5 mmol/L和5 mmol/L兩個濃度處理之間的差異也不顯著（圖1-B和1-D）。隨著處理時間的延長，處理組與對照組在14 d時無顯著差異（圖1-C和1-D）。因此尼克酰胺處理對小麥生長的影響較小。

2.2 測序數據質控與比對情況評估

RNA-seq的建庫質量及測序質量會對后續(xù)實驗分析產生較大影響，因此對測序數據的質控與評估十分重要。尼克酰胺（0 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L）處理7 d和14 d每個處理設置兩個重復共12組樣本，共95 Gb下機數據。利用Trimmomatic數據過濾共獲得約5000萬個Clean reads；FastQC軟質控結果顯示Q30大于92%；將Clean reads比對到小麥RefSeq v1.0參考基因組，樣本完全比率均在90%以上（表2）。質控及比對結果顯示下機數據可以很好的滿足后續(xù)分析的需求。

圖1 不同的組蛋白乙酰化抑制劑對小麥幼苗生長的影響

表2 測序數據質控與比對情況統(tǒng)計

2.3 相關性分析

利用R語言繪制PCA圖展示各樣本間以及同一處理不同重復的相關性（圖2）。第一個主成分PC1占投影特征的方差比例為60%，第二個主成分PC2占了23%的方差比例，兩者一起可以滿足我們的閾值。而且可以直觀的看到同一處理不同重復聚類在一起，說明重復間相關性較高，相同的時間處理也存在相關性。

圖2 主成分分析圖

2.4 基因差異表達分析

利用R語言的DEseq2包研究不同尼克酰胺處理的差異表達基因，依據校正后的P-value ＜ 0.05和差異變化倍數≥ 2，即2倍的差異變化的規(guī)則來定義差異表達基因。其中LFC ＞ 0表示基因表達上調，LFC ＜ 0表示基因表達下調。結果顯示，t7d-2.5和t7d-5分別與ctrl7d相比時差異表達基因有997和863個，其中有791和662個上調基因；另外，t14d-2.5和t14d-5與ctrl14d相比有144和318個差異表達基因，其中上調基因的數目分別是88和148個（圖3-A），t7d-2.5組中差異表達基因數目最多，t14d-2.5組最少。相同濃度下（2.5 mmol/L或5 mmol/L），尼克酰胺處理7 d的差異表達基因數目遠多于處理14 d，說明處理前期對小麥幼苗影響更大，這個結果與尼克酰胺處理14 d時小麥幼苗的生長狀態(tài)基本恢復到對照組一樣完全一致，因此與尼克酰胺處理相關的基因應該可以限定在處理7 d的差異基因中。處理時間相同情況下，t7d-2.5與t7d-5差異表達基因在數目上相差較少，且兩組有700個基因是相同的；而處理14 d，t14d-5組中差異基因數目比t14d-2.5多一倍，其中113個基因是相同的（圖3-B）。

圖3 差異表達基因分析

2.5 GO富集與pathway富集分析

GO（Gene ontology）即基因功能富集分析，是對基因在不同維度和不同層次上的描述。對基因的描述一般從3個層面進行：Cellular component（CC，細胞成分）、Biological process（BP，生物學過程）、Molecular function（MF，分子生物功能）。為了進一步研究不同處理時間對小麥轉錄組的影響，我們對7 d（t7d-2.5和t7d-5）和14 d（t14d-2.5和t14d-5）的所有差異表達基因進行GO富集分析（圖4，表3）。

對GO富集分析圖中主要terms進一步統(tǒng)計（表3）。尼克酰胺直接相關的“nicotianamine synthase activity term”、“nicotianamine biosynthetic process term” 集中出現在幼苗處理7 d，處理14 d未富集到這兩條terms，且上述兩terms內基因均下調表達，說明處理7 d以內的幼苗對尼克酰胺更加敏感。相比于7 d，14 d富集到的GO term主要為小麥生長常見term。尼克酰胺處理7 d的細胞分裂“cell division term”基因相對于對照組均表達上調，而處理7 d的甲基轉移酶“O-methyltransferase activity term”的基因則表現為下調表達。“transaminase activity term”氨基轉移通路基因也在7 d處理后相對于對照組表達上調。據統(tǒng)計，上述主要terms中所含基因共25個（不含重復）。

我們對上述中的terms中所涉及的基因使用Plant Reactome數據庫進行pathway富集分析。通過整合基因組、生化系統(tǒng)和化學分子等方面的數據，系統(tǒng)的分析基因產物功能，根據功能將這些注釋的pathway分為細胞過程、遺傳信息處理、環(huán)境信息通路、新陳代謝和生物有機系統(tǒng)5個類別（圖5）。結果發(fā)現“transaminase activity term”內基因關聯到多條與氨基酸代謝相關的pathway，其中賴氨酸合成VI通路包含在內（圖5）。

2.6 T1代TaAGO4a基因編輯材料陽性檢測及突變類型檢測

對T1代 分 別 來 自QA147-1，QA167-2和QA167-7三個株系的TaAGO4a基因編輯材料幼苗取樣提DNA，并進行PCR和PCR-RE檢測。共檢測47株材料，PCR擴增bar基因發(fā)現39株轉基因植株為陽性（圖6-A）。利用通用引物對AGO486F和AGO1404R擴增這些陽性轉基因植株的靶點序列并用限制性內切酶XmnI酶切對PCR產物酶切（PCRRE），檢測發(fā)現，39株植株TaAGO4a基因均未發(fā)生編輯（圖6-B）。

圖4 差異表達基因（DEGs）GO富集分析

表3 主要GO trems統(tǒng)計表

2.7 尼克酰胺處理后T2代TaAGO4a基因編輯材料的陽性檢測和突變類型檢測

我們對上述T1代TaAGO4a基因編輯材料的陽性植株的幼胚接種到培養(yǎng)基上進行尼克酰胺處理實驗，總共接種了69個幼胚并全部成苗，0 mmol/L，2.5 mmol/L和5 mmol/L培養(yǎng)基上分別有19、32、18株苗。上述材料培養(yǎng)至7和14 d時分別進行兩次取樣檢測，根據尼克酰胺處理時間與濃度共分為6組樣品（7-CK，7-2.5，7-5，14-CK，14-2.5，14-5）。首先對這些T2代植株檢測，發(fā)現42株為轉基因陽性植株（圖7-A），0 mmol/L，2.5 mmol/L和5 mmol/L培養(yǎng)基上分別有12、18和12株陽性。利用TaAGO4a基因通用引物（AGO4a486F和AGO4a1404R）對陽性植株進行PCR-RE檢測，結果顯示0 mmol/L、2.5 mmol/L和5 mmol/L處理7 d時都沒有檢測到編輯植株，0 mmol/L和2.5 mmol/L處理14 d時也沒有檢測到編輯植株，只有5 mmol/L濃度處理14 d檢測到1株雜合編輯植株（圖7-B），編輯效率為8.3%（表4）。

圖5 主要基因的Pathway分布圖

為了進一步檢測這株突變體材料的的編輯類型，我們分別利用3A，3B和3D三對特異性引物擴增靶點序列（圖8），PCR-RE結果顯示該材料發(fā)生編輯的是3A和3B基因組，3D基因組未發(fā)生編輯（圖8-A），突變體測序顯示3A和3B基因組編輯類型均為靶點處存在16 bp堿基缺失（圖8-B）。

圖6 T1代轉基因植株bar基因及突變類型檢測情況

圖7 14 d T2代轉基因植株bar基因及突變類型檢測情況

表4 各處理編輯情況統(tǒng)計

3 討論

3.1 HDACi對小麥幼苗生長的影響

Tiricz等［52］通過檢測細胞活力，發(fā)現丁酸鈉和尼克酰胺處理后的玉米細胞生長活力均未受到阻礙。而Bond等［49］利用丁酸鈉、TSA（Trichostatin A）和尼克酰胺3種HDACi處理擬南芥時發(fā)現尼克酰胺對擬南芥幼苗生長的影響較小，丁酸鈉和TSA相對會抑制擬南芥生長。本實驗結果也發(fā)現不同的組蛋白去乙酰化抑制劑對小麥幼苗生長的影響不同。不同濃度的丁酸鈉處理都嚴重抑了小麥幼苗的生長。這說明小麥幼苗對丁酸鈉反應敏感并不適合用來處理小麥。不同濃度的尼克酰胺處理小麥幼苗，前期（約7 d）幼苗生長較對照組緩慢，但處理至14 d，處理與對照生長并無明顯差異。雖然尼克酰胺處理前期會相對影響小麥苗的生長，但隨生長發(fā)育及小麥幼苗自身的調控作用適應了尼克酰胺處理，即尼克酰胺處理不會阻礙幼苗后續(xù)生長。因此用尼克酰胺處理小麥更合適。

3.2 尼克酰胺改變染色體狀態(tài)候選基因的篩選

組蛋白乙酰化的賴氨酸是SWI2/SNF2亞家族染色質重塑因子結構域識別和結合的位點，組蛋白H3上甲基化的賴氨酸是ISWI亞家族染色質結構域結合和識別的位點［58］，即賴氨酸與染色質重塑因子作用相關。組蛋白尾部賴氨酸殘基的α-氨基乙酰化是一種動態(tài)的染色質修飾。我們通過對主要GO富集轉氨基活性terms中差異表達基因的pathway富集分析發(fā)現這些參與轉氨基作用的基因與賴氨酸合成（Lysine biosynthesis VI）通路關聯密切，這說明尼克酰胺處理可能與染色質狀態(tài)有關。組蛋白修飾相關因子與甲基轉移酶（Dnmt）相互作用是組蛋白修飾調控基因表達的重要手段。研究表明Dnmt可與組蛋白去乙酰化酶（HDAC）、共抑制因子（Co-repressor）和ATP依賴的染色質重塑蛋白等結合形成抑制復合物，與組蛋白乙酰化和染色質重塑共同作用，從而抑制基因表達［59-61］。抑制Dnmt的基因表達與組蛋白修飾和染色質重塑相關［62］，比如Dnmt3a可與HP1（Heterochromatin protein 1）相互作用，而HP1具有識別甲基化的組蛋白、穩(wěn)定異染色質濃縮結構的作用。因此，抑制Dnmt3a表達有利于促進染色質開放［63］。本研究的GO富集分析發(fā)現，尼克酰胺處理導致6個Dnmt基因下調表達，而Dnmt基因下調有利于染色質開放，因此尼克酰胺處理可能促進染色質開放。開放區(qū)域染色質狀態(tài)相對松散，超過90%的開放區(qū)域與轉錄因子的結合相關且該區(qū)域細胞分裂活躍［22］。細胞分裂增強說明DNA復制活動增強，一般來說染色質的開放性在復制后會得到不同程度的恢復［64］。本研究中處理7 d有4個細胞分裂基因表達上調，說明尼克酰胺處理有利于染色質開放，進而有利于轉錄因子的結合以及基因的復制與轉錄等表達活動。綜上所述，尼克酰胺處理對染色質開放具有促進作用。

圖8 突變體材料編輯類型檢測

3.3 尼克酰胺處理和CRISPR/Cas9編輯效率的關系

Tiricz等［52］利用DNase I酶的敏感性發(fā)現5 mmol/L尼克酰胺和10 mmol/L丁酸鈉處理后染色質狀態(tài)更加開放，靶基因mGFP與ZmMEK1編輯效率更高。Bond等［49］在擬南芥中發(fā)現5 mmol/L尼克酰胺處理14 d誘導VIN3基因表達水平最高。本實驗利用尼克酰胺處理TaAGO4a基因的未發(fā)生編輯的基因編輯材料，結果顯示0 mmol/L，2.5 mmol/L和5 mmol/L處理7 d時都沒有檢測到編輯植株，而0 mmol/L和2.5 mmol/L處理14 d時也沒有檢測到編輯植株，只有5 mmol/L濃度處理14 d下檢測到1株A和B基因組均雜合編輯的植株，編輯效率從0提高到了8.3%。其中經過對PCR-RE產物測序發(fā)現3A基因組缺失了16 bp，而3B基因組則是在靶點處出現套峰，這說明酶切還不夠徹底，然后利用DSDecodeM（http：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/）分析發(fā)現3B基因組也缺失了16 bp［65］。因此5 mmol/L處理14 d是尼克酰胺處理小麥的最佳條件，這與之前在玉米和擬南芥中報道的最佳條件基本一致。這是首次在小麥中明確報道尼克酰胺可以促進編輯效率，進一步明確了尼克酰胺提高小麥基因編輯效率的可行性，也為提高小麥編輯效率提供了一種可行的新方法。

4 結論

相較于丁酸鈉，尼克酰胺對小麥生長影響較小。尼克酰胺處理有利于小麥染色質趨于開放狀態(tài)，第一次明確尼克酰胺可以提高小麥基因編輯效率，且5 mmol/L尼克酰胺處理14 d是最佳條件，編輯效率從0提高到了8.3%，而且實現了兩個基因組靶點的編輯。