水稻長日照開花因子Lfm1的圖位克隆

陳冰 陳國鑫 張治國

（中國農業科學院生物技術研究所，北京100081）

水稻（Oryza sativaL.）是我國主要的糧食作物，提高水稻糧食產量是農業科研中最主要的目標之一［1］。抽穗期（開花時間）與地區適應性以及產量密切相關，是受遺傳和環境影響的最大的性狀之一［2］。適度地調節水稻材料的開花時間將有助于充分利用當地的溫度和光照條件，進而提高水稻產量［3］。

水稻屬于短日照開花植物，在長期馴化過程中，逐漸從短日照向長日照、低緯度向高緯度繁衍，水稻已進化出適應長日照條件下的開花調控途徑。水稻成花素兩個基因RFT1與Hd3a，在水稻中也是關系最近的同源基因，但是RFT1在長日照下起作用，而Hd3a卻在短日照行使功能。目前，已鑒定一些長日照的開花調節因子SDG724、EHD4、DTH2等。SDG724編碼組蛋白甲基轉移酶，通過調控MADS50和RFT1位點的H3K36me2/3甲基化水平，影響“MADS50/MADS51-Ehd1-Hd3a/RFT1”途徑，促進水稻開花［4］。Ehd4基因編碼一個水稻特有的CCCH類鋅指蛋白，該基因通過誘導Ehd1調節成花素基因Hd3a和RFT1的表達從而控制抽穗［5］。DTH2是一個位于水稻第2染色體的在長日照下促進水稻抽穗的微效QTL，編碼一個CONSTANS類似蛋白，其表達受時鐘節律調控，DTH2 通過誘導成花素基因Hd3a和RFT1的表達而促進水稻抽穗，且獨立于已知的Hd1和Ehd1起作用［6］。值得一提的是，突變體rid1在中日照、短日照和長日照條件下均不開花，始終停留在營養生長階段，Rid1基因編碼Indeterminate domain（IDD）轉錄因子成員［7］。雖然鑒定了一些影響水稻長日照的開花基因如SDG724、RFT1、EHD4、DTH2，但是對挖掘水稻長日照開花基因還十分有限。

本課題組前期開展了長日照條件下光周期突變體的篩選，獲得了一批與長日照相關的突變體。本研究以一份長日照條件開花延遲的突變體lfm1為材料，利用圖位克隆的方法克隆Lfm1基因，探討了Lfm1基因在生產應用中可能存在的潛力，為培育適應不同生態區域的水稻品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

突變體lfm1材料來源于本實驗室前期創制的以日本晴為背景水稻突變體庫，突變性狀穩定遺傳且高代純合［8］。材料種植于海南陵水和河北廊坊基地，用于統計材料的生育期。PCR反應使用的聚合酶是南京諾維贊公司的2×Rapid Taq Master Mix（P222-AA）。分子標記由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 遺傳分析與群體構建 對突變體lfm1和野生型日本晴進行正反交，獲得F1代種子，并統計F2后代生育期，明確控制突變體lfm1表型的遺傳規律。同時以突變體lfm1母本，以秈稻廣親和材料Dular為父本進行雜交，配制基因定位群體。遺傳分析與群體構建在海南陵水和河北廊坊實驗基地進行。

1.2.2 水稻基因組DNA提取與PCR體系 日本晴、Dular、F2代群體的葉片基因組DNA提取參照改進的CTAB法［9］。采用10 μL反應體系：2×Rapid Taq Master Mix 5 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，模板DNA 50 ng，ddH2O 3 μL。PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃再延伸5 min。根據PCR產物差異大小，選擇4%的瓊脂糖凝膠（170 V，15 min）或者10%的聚丙烯胺凝膠（200 V，120 min）跑膠。

1.2.3 分子標記設計與基因定位 根據水稻秈粳亞種間基因組插入與缺失差異，在Gramene網站（http：//www.gramene.org）上進行粳稻品種日本晴與秈稻品種9311基因組序列比對，尋找兩亞種間存在插入與缺失變異的片段，利用Primer3web（http：//primer3.ut.ee/）在線設計引物，產物大小在100-200 bp左右。開發的初定Indel標記共296對，實際可用Indel標記157對，平均每隔2-3 M覆蓋水稻12條染色體。初定位用4個混池基因組DNA，每個混池有3個單株基因組DNA。同時提取200個F2代隱形表型單株基因組DNA用于精細定位和圖位克隆。

1.2.4 定位引物序列 設計引物，對候選區間Lfm1基因進行定位，定位引物如表1。

2 結果

2.1 長日照晚花突變體lfm1的發現

2015年5 月至10月在河北廊坊實驗基地種植水稻突變體庫（光照為長日照，容量10000份），在材料收獲時，發現一批在長日照下開花期有差異的材料。其中一個株系出現生育期延長現象，為了研究方便，后續將其命名為lfm1（圖1-A-C），將突變體lfm1移栽至大棚中（防止降溫對育性影響），～250 d后突變體才能正常結實（圖1-D）。為了進一步判斷突變體lfm1是否受短日照條件影響，我們將其種植于海南陵水基地（2015年12月-2016年4月生長），在短日照條件下，突變體lfm1的花期與野生型差異不太顯著，約95 d可開花結實（圖1-A、E）。

表1 引物序列

圖1 突變體lfm1開花期表型鑒定

2.2 突變體lfm1遺傳分析

由于突變體lfm1（生育期超長）在廊坊基地無法進行雜交，我們在海南基地對其進行了雜交配組，將lfm1與日本晴進行正反雜交，將獲取的F1代種植于廊坊基地（長日照條件），F1代均表現為正常開花表型（生育期～170 d），F2代出現晚開花和正常開花分離表型，對正反交植株按3∶1分離比進行了卡平方檢測，卡平方檢測值均小于Х20.05（1）=3.84（表2）。上述F1和F2代的遺傳分析表明，控制突變體lfm1在長日照下晚開花的表型受一對單隱性核基因控制，為下一步進行圖位克隆打下基礎。

表2 F2分離群體統計結果

2.3 Lfm1基因定位

為了定位Lfm1基因，在海南陵水實驗基地，配制突變體lfm1與秈稻材料Dular雜交組合，獲得大容量的F2代雜交種子，用于后續的定位試驗。首先，我們開發了一套分布在水稻12條染色體的180對具有多態性的Indel標記，平均每隔3 M。用這套引物對Lfm1進行初定位，發現該基因與標記8-0.121（圖2-A）和標記8-3.512（圖2-B）緊密連鎖，位于8號染色體的端粒附近（圖3-A）。進一步選取了19個單株，初步將Lfm1定位在8號染色體0.121-3.512M之間。

2.4 Lfm1基因的克隆與突變區間分析

利用200個F2代隱形單株對Lfm1基因進行精細定位（圖3-B），最終將Lfm1基因定位區間縮小到分子標記8-0.269和與8-0.283之間，范圍為12 kb，其中包括3個基因（LOC_08g01410，LOC_08g01420，LOC_08g01430）（圖3-C，表2）。然后對突變體lfm1中這3個候選基因進行測序，發現LOC_Os08g01420基因的第六外顯子有9 bp缺失（圖3-D）。經NCBI比對，發現LOC_Os08g01420基因編碼一個含有植物同源結構域的鋅指蛋白，是水稻開花的關鍵促進因子。經檢索水稻已報道ehd3突變體，突變位點LOC_Os08g01420處第六外顯子缺失11 bp，其生育期比對照顯著延長。突變體lfm1等位于突變體ehd3（圖3-D）［10］。長日照條件下，對一些開花基因進行了定量分析，結果表明，在lfm1突變體中，Ehd1、Hd3a和RFT1基因表達水平顯著下降，Ghd7轉錄水平提高，而Rid1和Hd1基因沒有變化，Ehd3可能依賴于Ehd1基因光周期遺傳途徑促進水稻抽穗。

圖2 Lfm1基因定位連鎖分析

圖3 基因Lfm1的圖位克隆

2.5 突變體lfm1的潛在育種價值

Lfm1是一個促進植物在長日照條件下開花的正因子，由于突變體lfm1在廊坊開花較晚，我們嘗試其在低緯度條件（長沙）進行生長，并進行評估，在長沙，lfm1的生育比對照增加了20 d（對照日本晴170 d，相對應對照增加190 d）。因此，突變體lfm1穗粒數有顯著提高（圖4-A-B），突變體lfm1結實率和千粒重與野生相比差別不顯著（圖4-C-D）。但是顯示突變體lfm1在適應的生態區具有巨大的生產應用潛力。

3 討論

開花期是育種家和科研工作者最關注的農藝性狀之一。合理的開花期對品種的選育和栽培至關重要。一般，在中國北方，需要選育開花期早的材料，而在南方，需要選育開花期適度晚的材料。水稻開花期受多個數量性狀基因影響，因此基因比較難以克隆，第一個控制水稻開花期的基因Hd1就是利用重組自交系進行克隆的［11］，也有一些利用染色體代換系進行克隆的［12-15］。而在本研究中，利用F2代材料就對Lfm1進行了成功克隆，有4點啟示：第一，對開花期基因的克隆，需要選擇后代分離3∶1的，這樣就克服親本背景材料對開花期基因的干擾。第二，對開花期基因的克隆，合理的種植條件也很重要，我們選擇了群體在廊坊這個天然的長日照條件下進行生長。第三，定位親本選擇很重要，雙親的生育期差距不要超過10 d。第四，開花期材料如果差別很大，可以選擇F2代進行定位克隆，如果差別不大，需要構建高世代材料進行定位。

圖4 突變體lfm1與野生型在長沙（正季）的穗性狀比較

通過圖位克隆Lfm1基因發現，Lfm1基因編碼一個含有植物同源結構域的鋅指蛋白，是水稻開花的關鍵促進因子。利用RICEVAR2.0網站對Lfm1基因利用單倍型分析，發現在已有秈稻和粳稻資源材料中，存在多個SNP和INDEL變異，但是這些變異都發生在非編碼區（內含子、5'-UTR、3'-UTR），表明LOC_Os08g01420是一個功能比較保守的基因，重要位點的突變如在編碼區的突變會影響水稻的生長發育。同時對比突變體ehd3和突變體lfm1的表型和突變方式，突變體ehd3不僅表現為生育期延遲，還比較弱勢生長特點［9］。對比突變方式，發現突變體ehd3是一個強突變體，可以用于后續的基因功能分析或作為背景材料的遺傳資源。而突變體lfm1雖然突變也發生LOC_Os08g01420的第六外顯子，其主要表型為生育期延遲，而無其它不利表型，因此突變體lfm1可能是一個LOC_Os08g01420基因的弱突變體材料。經在長沙種植，發現突變體lfm1的生育期比對照增加了20 d，由于生育期延遲，造成光合產物進一步積累，因此，突變體lfm1穗粒數有顯著提高，這個結果暗示突變體lfm1在適應的生態區具有潛在的生產應用潛力。將來，由于突變體lfm1不是轉基因材料，可以將其通過回交轉育聚合到不同生育期的水稻主栽材料中，培育適合不同地域的育種新材料。

4 結論

本研究通過篩選水稻突變體庫，獲得一份在長日照條件下晚開花的材料lfm1，其在短日照條件下能夠正常開花，通過圖位克隆，發現在突變體lfm1中，LOC_Os08g01420基因的第六外顯子2800處缺失9個堿基，突變體lfm1等位于突變體ehd3。并發現在適度的光照條件下，突變體lfm1表現為穗粒數增多，生育期略延長，可能存在潛在的生產應用潛力。