基于小鼠肝炎病毒研究遺傳工程小鼠隔離檢疫設計*

桂 飛 楊偉偉 俞利平 周 祥 汪海燕 孫筱品 戴方偉 宋曉明

(1. 杭州師范大學實驗動物中心, 杭州 310036)(2. 浙江省醫學科學院實驗動物中心, 杭州 310013)

隨著基因編輯技術的不斷進步，遺傳工程小鼠逐漸成為生命科學研究中應用最為廣泛的實驗動物，各大高校、科研機構每年需引進、制備大量品系的遺傳工程小鼠，其中很大比例來自科研院所的交流或從海外進口。這有效促進了生命科學相關領域的快速發展，同時引入一系列關于實驗動物病原微生物和寄生蟲質量控制的難題。一旦隔離檢疫環節出現疏漏，往往導致大規模、持續性病原感染，不僅嚴重影響科研成果準確性，更威脅到從業人員健康和生命安全。檢測機構在接收委托檢測時發現，很多機構采用遺傳工程小鼠背景鼠—C57BL/6小鼠作為哨兵鼠進行隔離檢疫和常規病原監測。我國對入境活體動物的隔離檢疫，綜合《進境動物檢疫疫病名錄》相關鼠病和國標《實驗動物 微生物學等級及監測》[1]要求，將SPF鼠隔離期由30 d調整為14 d[2]，在1～2周內需實現病原檢測是否可行以及如何實現是實驗動物管理人員都需面對的現實問題。

小鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus, MHV)屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬，基因組為線性不分段的單股正鏈RNA[3]。 MHV感染是一種嚴重危害小鼠生產的病毒性傳染病，正常情況下呈隱性感染，應激激發時會誘發致死性病變，是一種廣泛傳播且頑固的病原，難于被發現和有效控制，MHV已是遺傳工程小鼠微生物控制中最難于生物凈化的病原之一[4]。目前，針對MHV的診斷方法有病毒分離與鑒定、血清學試驗、組織病理學診斷和分子生物學診斷等。本文以MHV為例，研究兩種品系小鼠作為哨兵鼠在MHV感染后，病毒核酸檢測量和血清抗體變化規律，以期為遺傳工程小鼠隔離檢疫以及常規病原檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：6～8周齡C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠各10只，雌雄各半，由杭州師范大學實驗動物中心提供，生產許可證：SCXK(浙)2016-0004，小鼠飼養在屏障系統隔離器中，使用許可證：SYXK(浙)2016-0006，動物自由采食和飲水。待動物充分適應環境后，在符合動物福利的條件下進行實驗。

1.1.2試劑:DNA/RNA Isolation Kit(TIANGEN DP422)核酸提取試劑盒以及Fast Quant RT Kit(With gDNase)(TIANGEN KR106)反轉錄試劑盒購自天根生化科技有限公司；小鼠肝炎病毒實時熒光定量PCR檢測試劑盒TaqMan? Gene Expression Master Mix(ABI 4369016)購自ABI公司；小鼠肝炎病毒ELISA檢測試劑盒購自Xpress Bio公司。

1.1.3主要儀器與設備：微量紫外分光光度計(Thermo Nanodrop 2000)、 普通PCR擴增儀(Bio-RAD)、實時熒光PCR儀(ABI One step plus)、生物安全柜(Thermo)、酶標儀(Molecular Devices)、 DEM-3型自動洗板機(北京拓普分析儀器有限責任公司)。

1.2 方法

1.2.1引物與探針的設計：從NCBI的FTP中下載兩株MHV基因組序列，經分析比對、Primer Premier 5.0 軟件設計熒光定量PCR引物和探針以及實驗篩選和驗證，選取29843-31210 Murine hepatitis virus strain JHM為靶基因。引物、探針(見表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 MHV TaqMan熒光定量PCR引物及探針序列

1.2.2樣品的收集及前處理：C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠作為哨兵鼠，參照常規的遺傳工程小鼠隔離檢疫方式進行如下設計：小鼠雌雄各半，分4籠放入同一個隔離包中，使用經MHV核酸檢測陽性的小鼠臟墊料為感染源，均分后感染待檢哨兵鼠。哨兵鼠每周更換2次臟墊料，使其自然感染。接觸飼養28天后停止接觸臟墊料，每只小鼠進行單籠飼養并取樣直至實驗結束。在第7、14、21、28、42、56天分別將每只實驗小鼠取出至經高壓滅菌的籠盒中，待其自然排便后采集小鼠的新鮮糞便，同時采集血樣。取50 mg糞便用液氮研磨法[5]，加入600 μL裂解液，充分混勻后，按試劑盒操作步驟提取。血液經3 000 r/min、5 min離心后，取血清放置于-20 ℃備用，待所有血清收集完成后，使用ELISA檢測試劑盒檢測血清MHV特異性抗體。

1.2.3核酸提取：將采集的糞便樣本，按照TIANGEN DP422核酸提取試劑盒說明書，手動提取病毒RNA，并進行核酸濃度測定，常規方法反轉錄成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.2.4實時熒光定量TaqMan-PCR檢測及判定標準：用TaqMan試劑盒對提取的病毒RNA進行檢測，反應體系如下： 2×TaqMan Fast Advanced Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L) 各 0.5 μL，探針(5 μmol /L) 1.0 μL，模板cDNA 2.0 μL，補水至 25 μL。擴增程序為： 50 ℃孵育2 min，95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性 15 s，60 ℃退火延伸 1 min，共 40 個循環，收集熒光信號并讀取數據。

參考《中國實驗動物學會團體標準匯編及實施指南》[6]，若待檢測樣品無熒光擴增曲線，則判定樣品未檢出小鼠肝炎病毒。若待檢測樣品有熒光擴增曲線，且Ct值應≤35時，則判斷樣品中檢出小鼠肝炎病毒。若待檢測樣品Ct值介于35和40之間時，應重新進行實時熒光RT-PCR檢測。重新檢測后，若Ct值≥40時，則判定樣品未檢出小鼠肝炎病毒。重新檢測后的Ct值仍介于35和40之間，則判定樣品檢出小鼠肝炎病毒。

1.2.5血清抗體檢測及判定標準：應用XpressBio公司小鼠肝炎病毒ELISA檢測試劑盒，按照說明書步驟進行檢測。在405 nm波長處，待檢測樣本光吸收值與相應陰性對照孔的光吸收值的差值≥0.3時，則判定該待測樣本中檢出小鼠肝炎病毒。

1.2.6統計學分析：數據運用SPSS statistics 22軟件處理，采用Cohen’s kappa系數[7]分析兩種檢測方法對樣本陽性判斷的一致性，P< 0.05為差異顯著；P< 0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 C57BL/6小鼠糞便中肝炎病毒檢測量與血清抗體的變化結果

C57BL/6小鼠qPCR檢測結果(表2)表明，在接觸含小鼠肝炎病毒臟墊料的第7天、第14天和第21天均未從單獨采集的糞便中檢出病毒核酸，在第28天、第42天各有兩只C57BL/6小鼠糞便中檢出病毒核酸陽性，陽性率僅為20%，2個陽性樣本的平均Ct值分別為(37.31±1.35)和(36.36±3.06)。第56天所有糞樣均為陰性，未檢出病毒核酸。由血清MHV特異性抗體結果(表2)可知，在整個臟墊料接觸期(第1天至第28天)以及之后四周的單獨飼養期均未從本項目設計的C57BL/6哨兵鼠血清中檢出MHV特異性抗體。

由表2可知，當采用 C57BL/6小鼠作為隔離檢疫的哨兵鼠使用時，qPCR法在第28天小鼠糞樣中檢出MHV陽性，檢出率僅為20%，第42天陽性數量未增加，到第56天時糞便病毒載量已經低于qPCR檢測限。采用ELISA法檢測血清MHV特異性抗體的結果則表明，本研究所設計的整個隔離檢疫策略無法檢出陽性樣本。

表2 C57BL/6小鼠糞便中肝炎病毒的檢測量與血清中抗體的變化結果

2.2 BALB/c小鼠糞便中肝炎病毒的檢測量與血清抗體的變化結果

qPCR檢測結果(表3)發現，在BALB/c小鼠與臟墊料接觸期的第21天，從單獨采集的糞便中可檢測出少量的MHV核酸，qPCR方法的檢出率為20%，平均Ct值為(38.70±0.99)。在第28天，從10只BALB/c小鼠中檢出7只小鼠的MHV核酸陽性，陽性率為80%，陽性樣本的平均Ct值為(27.31±6.85)，經脫離臟墊料環境飼養兩周后，第42天也有5只BALB/c小鼠檢出MHV核酸陽性，在第56天qPCR未能檢出陽性。

ELISA檢測結果(表3)顯示，在接觸感染期(第1天至第28天周)血清抗體檢測結果均為陰性，在第42天和第56天，待檢的10只哨兵鼠中有5只BALB/c小鼠血清特異性抗體檢測呈陽性，且第56天抗體OD值與第42天相比有顯著提高。

表3 BALB/c小鼠糞便中肝炎病毒的檢測量與血清抗體的變化結果

配對卡方檢驗發現，感染前28 d，僅qPCR方法可檢測出陽性；第42天兩種方法均可檢出陽性，且兩種檢測方法的Cohen’s kappa系數為1，P<0.01，具有很強的一致性。而第56天僅ELISA方法檢測出陽性。由表3可知，在模擬常規隔離檢疫的臟墊料接觸感染21 d后，有20% BALB/c小鼠糞樣qPCR檢測為陽性，第28天有80%BALB/c小鼠糞樣檢出陽性，第42天仍有50%陽性率。采用ELISA法檢測特異性抗體時，第21天、第28天均無陽性血樣檢出，僅在第42天時開始檢測到抗體陽性，表明qPCR檢測糞樣病毒核酸較ELISA法測血清抗體具有早檢出且檢出率更高的特點，更能達到隔離檢疫的目標。

2.3 C57BL/6和BALB/c小鼠糞便中MHV核酸檢測量與血清抗體變化的比較

將C57BL/6和BALB/c兩品系小鼠糞便中MHV qPCR核酸檢測量進行對比(圖1)后發現，BALB/c小鼠在感染第21天，從糞便中即可檢測出少量MHV核酸陽性，隨后病毒含量呈上升趨勢；C57BL/6小鼠在感染后第28天才能檢出，從Ct值判斷其病毒含量一直處于較低水平。兩品系小鼠的血清抗體檢測結果對比顯示，C57BL/6小鼠直至第56天，均未檢測出抗體陽性，BALB/c小鼠隨著肝炎病毒檢測量的增加，從第42天開始血清抗體水平持續增加。當血清抗體增加到一定程度后，病毒檢測量出現了下降(見圖1)。因此，本研究結果表明，針對小鼠肝炎病毒BALB/c小鼠較C57BL/6更易感，且更易引起機體的免疫應答反應。

圖1 C57BL/6和BALB/c小鼠糞便中肝炎病毒檢測量與血清抗體的變化結果

3 討論

從實驗結果看，BALB/c小鼠在當前的感染條件下，MHV感染后糞便中病毒載量的變化呈先升后降的趨勢，第21天開始檢出少量，第28天檢測含量最高，隨后下降，第56天未能檢出，這表明小鼠在感染前期，因體內未產生抗體，病毒處于復制期，當病毒復制到一定量后刺激機體發生免疫反應，產生抗體，從而使感染后期病毒載量出現下降趨勢；感染后期才出現小鼠肝炎病毒抗體，與Scavizzi和Raspa等[8]實驗結果基本一致。且糞便中病毒載量與血清抗體的變化呈負相關關系。本研究中采用自然感染的方式，所用的感染源MHV含量較低，就病毒檢出時間和檢出率來看，自然感染小鼠排毒時間較人工感染小鼠肝炎病毒排毒明顯滯后[9]，可能毒株的類型和其毒力的強弱有關，也可能與感染途徑或方式有關。

通過比較不同品系小鼠發現，C57BL/6小鼠對MHV不太敏感，在整感染過程中，從糞便中僅檢測出極少量病毒，且未能刺激機體產生抗體。BALB/c小鼠對MHV較易感，誘導產生較強烈的免疫反應，產生抗體。Shigeru Kyuwa等[10]也發現在BALB/c小鼠的原代肝細胞增殖的MHV滴度比C57BL/6小鼠的原代肝細胞增殖的要高，提示BALB/c小鼠較C57BL/6小鼠對小鼠肝炎病毒更易感，可為哨兵鼠的選擇提供參考依據。

在隔離檢疫的過程中，通過小鼠糞便，可以較早檢測小鼠肝炎病毒的感染情況，提早確定病原微生物的感染狀況；感染后期，血清抗體相對穩定，與劉香梅等[11]報道結果相一致。研究提示可結合糞便中病原微生物檢測和血清抗體含量的檢測方法，綜合評價實驗動物病原微生物的感染狀況，從而有效控制病原微生物的感染。

針對本研究選用的小鼠肝炎病毒，無論是用qPCR法還是ELISA法，BALB/c作為哨兵鼠比C57BL/6小鼠有更高的檢出率，鑒于MHV是遺傳工程小鼠最主要的感染病原之一，我們建議在隔離檢疫和常規病原檢測中，選用BALB/c替代C57BL/6作哨兵鼠。同時在大鼠或小鼠進行隔離檢疫時，糞便和其他排泄物均用PCR法來監測傳染性病原體。