5 種通關藤花粉活力測定方法比較*

劉成琴，趙興旺，康志鈺，丁家娟，孫映雪，王建軍

(云南農業大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

通關藤[Marsdenia tenacissima(Roxb.) Wight et Arn.]為蘿藦科牛奶菜屬藤本植物，分布于云南、廣西和貴州等省區，是西南地區常用的民族藥之一[1-2]。其味苦，性微甘，具有消炎止痛、清熱解毒、止咳平喘等作用。臨床廣泛應用于治療各種惡性腫瘤，療效良好，是臨床必用的抗腫瘤藥物之一[3]。云南省紅河州是通關藤的地道產區，近幾年通關藤的貯藏量急劇下降，很多地方的通關藤遭到了嚴重砍伐，有些甚至是連根挖走，極不利于通關藤的自然更新[4]。

蘿摩科植物的花粉以花粉塊的形式存在，這是該科植物的典型特征，通關藤尤為典型。蘿摩科植物的坐果率一般較低，平均0.33%～5.00%[5]。目前，國內外對通關藤的研究主要集中在化學成分、藥理活性、種子萌發、資源調查和真偽鑒定等方面，而對其花粉活力測定方法鮮見報道。目前，規范化栽培和野生撫育種植的種苗均以種子為繁殖材料[6]。但由于通關藤坐果率普遍較低，使通關藤花多果少，產生的種子數量也少，成為利用種子進行擴大繁殖的限制因素之一。本研究采用不同方法測定通關藤花粉活力，并通過對比分析，篩選出通關藤花粉活力測定的最佳方法。對提高通關藤坐果率具有重要意義，也為通關藤的快速繁殖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料的采集與處理

試驗材料于2019 年5—6 月采自云南省紅河州蒙自市水田鄉通關藤種植示范基地，選取處于初花期、盛花期和末花期的花，迅速帶回實驗室，用解剖針將花粉塊取下，分別利用TTC 染色法、醋酸洋紅染色法、I2-KI 染色法、過氧化物酶染色法以及花粉離體萌發法5 種方法進行花粉活力測定。

1.2 花粉活力測定方法

(1) TTC 染色法

取3 朵花的花粉置于普通載玻片上，滴入質量分數為0.5%的TTC 溶液2 滴，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，于25～28 ℃放置15～20 min。在顯微鏡下觀察不同的5 個視野，凡被染成紅色的均為有生活力的花粉粒[7]。

(2) I2-KI 染色法

取3 朵花的花粉于干凈的普通載玻片上，加水1 滴，使花粉散開，再加1 滴碘—碘化鉀溶液，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。取5 個視野進行觀察并計數，凡被染成藍色的均為有生活力的花粉粒[7]。

(3)醋酸洋紅染色法

取3 朵花的花粉放在載玻片上，并滴入1～2 滴醋酸洋紅溶液，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，片刻后在顯微鏡下觀察5 個不同的視野，有活力的花粉被染成紅色[8]。

(4)過氧化物酶沉淀法

先配制試劑Ⅰ：0.5%聯苯胺、0.5% α-萘酚、0.25%碳酸鈉各10 mL 混合均勻。在干凈載玻片上放3 朵花的花粉，然后加試劑Ⅰ和0.3% 過氧化氫各1 滴，攪勻后蓋上蓋玻片，將制片放置30 ℃恒溫箱中10 min，置于顯微鏡下觀察，取5 個視野統計并記錄被染為紅色的花粉數量[9]。

(5)花粉離體萌發法

先配置A、B 2 種培養基[10]，用解剖針將3 朵花的花粉塊取下放在凹面載玻片上，分別滴入2～3 滴B 培養基，將載玻片放入裝有濕濾紙的培養皿中再蓋上一較大的培養皿，置于30 ℃的恒溫培養箱中暗培養，培養24 h，取出，滴入20%的KOH 溶液使花粉塊壁溶解，然后壓片并在顯微鏡下選5 個不同視野觀察并計數。

以上5 種方法均在10 倍顯微鏡下觀察，每種方法3 次重復。

1.3 數據處理

數據采用SPSS 19.0 和Excel 2010 處理，顯著性方差分析利用LSD 法。

2 結果與分析

2.1 不同測定方法下花粉活力比較

從5 種通關藤花粉活力測定結果來看(圖1)：花粉活力由高到低依次為I2-KI 染色法＞醋酸洋紅染色法＞TTC 染色法＞過氧化物酶染色法＞花粉離體萌發法。其中花粉離體萌發法測得的花粉活力最低，只有0.02%。醋酸洋紅染色法、TTC 染色法和過氧化物酶染色法也比較低，分別為52.10%、51.44% 和39.02%，且三者之間差異不顯著。I2-KI 染色法測得的花粉活力最高，達到了90.85%。因此最適合的通關藤花粉活力測定方法為I2-KI 染色法。

圖1 不同測定方法下通關藤花粉活力比較Fig.1 Comparison of pollen viability of M.tenacissima under different determination methods

2.2 不同花期花粉活力比較

由于測定花粉活力最好的方法為I2-KI 染色法，所以用該方法測定了通關藤初花期、盛花期和末花期的花粉活力。從各個時期花粉活力比較來看(圖2)，花粉活力最高的為初花期達到90.85%，盛花期次之為79.40%，最低的是末花期花粉活力為69.16%。初花期和末花期差異顯著，初花期和盛花期差異不顯著，盛花期和末花期差異不顯著。

圖2 不同花期通關藤花粉活力比較Fig.2 Comparison of pollen viability in different M.tenacissima flower periods

3 討論

花粉活力直接關系到雜交授粉的成功率。花粉活力檢測方法主要有花粉離體培養法和染色法[11]。花粉離體萌發法測定花粉活力時易受溫度、pH 值、營養物質和礦質元素等的影響[12]。染色法對花粉活力測定具有簡單、快速的優點，但不同植物花粉適宜的染色方法不同[13]。因此篩選適合測定某種植物花粉活力的染色法在雜交育種上具有非常重大的意義。

本研究采用的TTC 染色法、醋酸洋紅染色法、I2-KI 染色法、過氧化物酶染色法和花粉離體萌發法5 種測定通關藤花粉活力的方法中，TTC染色法、醋酸洋紅染色法和過氧化物酶染色法測出的花粉活力都相對較低，顏色較淺，染色效果不佳。可能是由于花粉塊的膜沒有充分破壞，導致花粉不能完全分散開，也有可能是通關藤花粉塊的特殊結構和含有特殊成分使得這3 種方法不適合其花粉活力的測定。此外，TTC 染色法的染色效果還可能與花粉的呼吸作用和花粉外壁的結構有關[14]。花粉離體萌發法測定的花粉活力最低，在試驗中發現培養4、6 和8 h 花粉都不萌發，只在培養24 h 時分別在初花期和盛花期的1 個視野中發現了1 粒花粉萌發。可能是本試驗所用培養基不適合通關藤花粉萌發，對其萌發最適合的培養基的確定還有待進一步的研究。本研究中I2-KI 染色法的染色率最高，而且各重復之間差異顯著，所以I2-KI 染色法能準確地反應通關藤的花粉活力，可作為測定通關藤花粉活力最佳的方法。這與在肋柱花[13]、大葉相思[15]等植物上的研究結果一致。這可能是通關藤花粉中淀粉含量較高，I2-KI 容易滲透進花粉壁使花粉粒著色。在本研究中還發現通關藤花粉活力隨著花齡的增大而減小，但是在通關藤的整個花期中都保持著花粉活力，這可能是通關藤適應蘿藦科植物傳粉率低、坐果率低的一種機制。

4 結論

本研究采用的5 種測定通關藤花粉活力方法中，TTC 染色法、醋酸洋紅染色法和過氧化物酶染色法測出的花粉活力都相對較低，顏色較淺，染色效果不佳，而I2-KI 染色法測得的花粉活力高達90.85%。所以，I2-KI 染色法為測定通關藤花粉活力有效的方法，并且隨著花齡增大花粉活力有所下降。