天麻素對戊四氮致癇模型大鼠的治療作用及對細(xì)胞自噬、凋亡機(jī)制的研究

翁檸，況時(shí)祥，薛紅，何前松，王強(qiáng)，劉建輝，趙芝蘭，李艷

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導(dǎo)致大腦功能障礙的一種慢性疾病[1]。癲癇的病因復(fù)雜多樣，常見的有遺傳因素、腦部疾病、全身性或系統(tǒng)性疾病[2-3]。其中先天及圍產(chǎn)期因素、遺傳代謝性疾病、皮質(zhì)發(fā)育異常所致的畸形等病因多發(fā)生于新生兒及嬰兒期；而特發(fā)性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腦發(fā)育異常等多發(fā)生于兒童及青春期；頭顱外傷、腦腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性因素等多發(fā)生于成人期；腦血管意外、腦腫瘤、代謝性疾病、變性病等則多發(fā)生于老年期[4-5]。根據(jù)我國最新流行病學(xué)資料顯示，國內(nèi)癲癇病患者日益增加，已經(jīng)發(fā)展成為神經(jīng)科內(nèi)僅次于頭痛的第二大常見病[6-7]。因此，本研究建立戊四氮致癇大鼠模型，積極探索癲癇的發(fā)病機(jī)制及癲癇的有效治療藥物，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： Wistar健康雄性大鼠(購于三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)120只，體質(zhì)量160～220(180.50±37.52)g，于室溫24℃、濕度45%的干凈籠子里喂養(yǎng)，飲水和飼料均進(jìn)行消毒之后自由食用。(2)試劑試藥：天麻素(源葉生物公司生產(chǎn))、戊四氮(PTZ)(Sigma公司生產(chǎn))、10%水合氯醛(上海雅吉生物科技有限公司生產(chǎn))，PBS緩沖液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，蛋白緩沖液(上海谷研實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn))，TBST液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，4%多聚甲醛(臨沂盛陽化工有限公司生產(chǎn))，兔抗小鼠Bax抗體(Selleck公司生產(chǎn))，大鼠抗兔Beclin1抗體(CiteAbc公司生產(chǎn))，大鼠抗小鼠Caspase-3(Abcom生產(chǎn))，兔抗大鼠LC3抗體(Bioworld生產(chǎn))。(3)儀器設(shè)備：光學(xué)顯微鏡(BX53型，OLYMPUS，奧林巴斯株式會(huì)社生產(chǎn))，電泳儀(型號(hào) YQDL001/YQDL002，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品)，成像儀(型號(hào) Lux2 ，普邁精醫(yī)科技有限公司產(chǎn)品)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2018年11月—2019年11月于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 癲癇模型制作：大鼠自由飲水和攝食5 d后，使用戊四氮(32 mg·kg-1·d-1)+生理鹽水配制成濃度為2.5 mg/L溶液腹腔注射,每日清晨注射1次，每次給藥后觀察30 min,連續(xù)注射28 d；停藥7 d后，再次同樣使用PTZ亞驚厥劑量32 mg·kg-1·d-1+生理鹽水配制成濃度為2.5 mg/L溶液腹腔注射,每日清晨注射1次，連續(xù)5 d。根據(jù)Racine分級法對大鼠行為驚厥評分分級，凡連續(xù)4次出現(xiàn)2級以上發(fā)作或者連續(xù)出現(xiàn)2次5級癇性發(fā)作即判定該鼠被點(diǎn)燃，視為造模成功。通過篩選將造模成功的100只癲癇模型大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為戊四氮致癇模型組、丙戊酸鈉(VPA)干預(yù)組、天麻素小劑量干預(yù)組、天麻素中劑量干預(yù)組、天麻素大劑量干預(yù)組，每組20只，另外20只為正常對照組，共120只。造模成功后除正常對照組外，各組均予維持量PTZ(20 mg·kg-1·d-1)腹腔注射維持癇性發(fā)作。在腹腔注射PTZ之前2 h，模型組腹腔注射生理鹽水,天麻素小、中、大劑量干預(yù)組分別于大鼠腹腔注射天麻素30、60、120 mg·kg-1·d-1，丙戊酸鈉干預(yù)組于大鼠腹腔內(nèi)注射丙戊酸鈉(120 mg·kg-1·d-1)，共治療14 d。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 腦組織取材：當(dāng)大鼠造模成功并干預(yù)2周后，取其腦海馬組織進(jìn)行切片(統(tǒng)一取左側(cè)海馬組織)，大鼠造模最后一次注藥1 d后，采用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉之后斷頭取腦，腦組織放在冰盤內(nèi)沿矢狀縫對切，左側(cè)海馬區(qū)組織使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，然后進(jìn)行脫水、浸蠟后包埋，以備切片。

1.3.2 免疫組化檢測微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC3)、Bax表達(dá)：對大鼠海馬組織石蠟切片行脫蠟、脫水等處理后，浸泡于0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中，并進(jìn)行熱修復(fù)，3% H2O2環(huán)境下培育10 min，滴入山羊血清，26℃環(huán)境中培養(yǎng)30 min，抽離封閉液、添加一抗，將其置于5℃環(huán)境中過夜培養(yǎng)，次日加入二抗，37℃恒溫箱中培養(yǎng)30 min，清洗后進(jìn)行封片。LC3、Bax陽性表達(dá)為棕黃色或黃色細(xì)顆粒狀，使用半定量評分法對染色結(jié)果進(jìn)行評定，每切片取10個(gè)高倍視野，取其平均值為最終判定結(jié)果。

1.3.3 Western-blot法檢測自噬相關(guān)蛋白(Beclin1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達(dá)：首先使用PBS緩沖液對海馬區(qū)組織標(biāo)本進(jìn)行沖洗，隨后裂解30 min，裂解后測定其蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，電泳的同時(shí)加入蛋白緩沖液，10 min后把電轉(zhuǎn)膜放置到濃度為10%牛奶中進(jìn)行浸泡，常溫環(huán)境下封閉2 h。封閉后結(jié)合一抗孵育1 d，第2天取出后使用TBST液進(jìn)行沖洗，隨后結(jié)合二抗。1 h后進(jìn)行清洗、顯色，對Beclin1、Caspase-3表達(dá)進(jìn)行檢測。

1.3.4 TUNEL法檢測海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率：海馬組織于常溫環(huán)境中使用20 μg/ml蛋白酶K培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白，使用PBS緩沖液進(jìn)行徹底清洗，將平衡緩沖液100 μl加入其中，室溫環(huán)境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反應(yīng)液100 μl，避光、室溫環(huán)境中孵育1 h，之后加入SSC溶液100 μl，常溫環(huán)境中靜置20 min后進(jìn)行清洗3次，使用DAPI進(jìn)行復(fù)染，滴加DAPI避光孵育 5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 洗去多余的DAPI。用吸水紙擦干切片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。熒光顯微鏡下組織切片中凋亡的細(xì)胞呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。取每切片3個(gè)視野進(jìn)行觀察、計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠存活情況 實(shí)驗(yàn)過程中，模型組大鼠死亡2只，天麻素小劑量組死亡2只，天麻素中劑量、大劑量組及丙戊酸鈉干預(yù)組死亡各1只，最終存活大鼠113只。

2.2 各組大鼠腦組織LC3、Bax表達(dá)比較 與正常對照組比較，模型組LC3、Bax表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，天麻素各劑量組、丙戊酸鈉干預(yù)組LC3、Bax表達(dá)量表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與丙戊酸鈉干預(yù)組比較，天麻素小劑量、中劑量組LC3、Bax表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，天麻素大劑量組LC3、Bax表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LC3、Bax表達(dá)量在天麻素小、中、大劑量各組間依次下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1、2。

表1 各組大鼠腦組織LC3、Bax表達(dá)比較

2.3 各組大鼠腦組織Beclin1、Caspase-3表達(dá)比較 與正常對照組比較，模型組Beclin1、Caspase-3表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，天麻素各劑量組、丙戊酸鈉干預(yù)組Beclin1、Caspase-3表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與丙戊酸鈉干預(yù)組比較，天麻素小劑量、中劑量組腦組織Beclin1、Caspase-3表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，天麻素大劑量組Beclin1、Caspase-3表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Beclin1、Caspase-3表達(dá)量在天麻素小、中、大劑量各組間依次下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 各組大鼠腦組織Beclin1、Caspase-3相對表達(dá)量比較

圖1 各組大鼠海馬區(qū)LC3表達(dá)比較(免疫組化染色，×400)

圖2 各組大鼠海馬區(qū)Bax表達(dá)比較(免疫組化染色， ×200)

注：A.正常對照組；B.模型組；C.天麻素小劑量組；D：天麻素中劑量組；E：天麻素大劑量組；F：丙戊酸鈉干預(yù)組

2.4 各組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率比較 與正常對照組(2.91±0.53)% 比較，模型組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率[(58.77±4.52)%]升高(t=54.930，P=0.001)；與模型組比較，天麻素小劑量組(21.58±2.71)%、天麻素中劑量組(12.74±2.10)%、天麻素大劑量組(9.19±1.88)%、丙戊酸鈉干預(yù)組(9.21±1.85)%,海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.591 ，P=0.031)；而丙戊酸鈉干預(yù)組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率與天麻素大劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

3 討 論

天麻是著名的中藥材，潤而不燥，主入肝經(jīng)，長于平肝息風(fēng)，其性辛、溫、無毒，有抗癲癇、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痙、鎮(zhèn)痛、平肝息風(fēng)的功效。天麻主要含天麻素、天麻醚苷、天麻多糖、對羥基苯甲醇、香莢蘭素、蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素等多種成分，其中天麻素是天麻的主要活性成分，其含量高低是天麻質(zhì)量的重要指標(biāo)。天麻素能夠擴(kuò)張腦血管、提高腦細(xì)胞抗缺氧能力、增加腦血流量，對神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，清除過多的自由基，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能等[8-9]。戊四氮又稱卡地阿唑，一種白色結(jié)晶的粉末狀化學(xué)品，為中樞興奮藥[10],也是研究較多的癲癇動(dòng)物模型誘導(dǎo)藥之一。癲癇是一種反復(fù)發(fā)作的慢性腦部疾病，其有著反復(fù)性和短暫性的特點(diǎn)[11-12]。迄今為止，仍有部分難治性癲癇患者無法得到治愈。所以研究癲癇的發(fā)病機(jī)制及治療癲癇的新型藥物，具有重要意義。

癲癇的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，近年來研究認(rèn)為，癲癇發(fā)生與海馬區(qū)細(xì)胞程序性死亡如凋亡與自噬密切相關(guān)[13-14]。細(xì)胞的過度自噬反而會(huì)加重細(xì)胞損傷程度，嚴(yán)重的可能會(huì)致使細(xì)胞死亡[15-16]。細(xì)胞自噬是形成雙層膜的自噬泡，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)包裹起來，然后通過溶酶體融合并消化掉的過程。LC3是酵母自噬相關(guān)基因8，主要存在于哺乳動(dòng)物中，在自噬體的形成階段，LC3-Ⅰ被包括Atg3和Atg7在內(nèi)的泛素樣體系修飾加工，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，并定位到自噬小體中。自噬小體中的LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ都可以作為細(xì)胞發(fā)生自噬的分子標(biāo)志，同時(shí)LC3-Ⅱ的水平與自噬表達(dá)程度呈正相關(guān)，因此LC3可以作為自噬水平的檢測指標(biāo)。Bax屬于兔抗人單克隆抗體，是與Bcl-2同源的水溶性相關(guān)蛋白，是Bcl-2基因家族中細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因，Bax的過度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于死亡[17-19]。自噬相關(guān)蛋白Beclin1不僅能夠促進(jìn)真核細(xì)胞的自噬，同時(shí)還參加了細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)。吳瓊等[20]在研究中指出，癲癇模型大鼠體內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)異常升高，說明Beclin1表達(dá)能反映大鼠海馬神經(jīng)元的自噬活動(dòng)。Caspase-3為一種蛋白酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的核心酶，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Caspase-3的出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[21-22]。當(dāng)炎性因子和信號(hào)蛋白相應(yīng)激活Caspase-8后會(huì)引起級聯(lián)反應(yīng)，從而激活Caspase-3引起細(xì)胞的凋亡。有研究報(bào)道，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL細(xì)胞)殺傷機(jī)制的重要組成部分[23-24]。

綜上，天麻素能調(diào)控戊四氮致癇模型大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)因子LC3、Bax、Caspase3、Beclin1等表達(dá)，提示天麻素可通過調(diào)節(jié)凋亡、自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，抑制癲癇發(fā)作，為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

圖4 各組大鼠細(xì)胞凋亡率比較(熒光染色,×200)

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

翁檸：提出研究方向、研究思路，研究選題，論文撰寫，論文修改審核；況時(shí)祥：研究選題分析，論文修改；薛紅：設(shè)計(jì)論文框架，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);何前松：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理；王強(qiáng)：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；劉建輝：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；趙芝蘭、李艷：實(shí)施研究過程