青海省青稞條紋病菌遺傳多樣性分析

胡章薇，楊 帆，閆佳會，侯 璐，翁 華，姚 強

（青海大學農林科學院/青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室/農業農村部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海西寧810016）

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudum Hook.f.）又名裸大麥，為禾本科大麥屬植物，屬于栽培大麥的變種，其特點是成熟時籽粒內外稃與穎果分離，籽粒裸露[1]。青稞在藏族同胞的食物結構中舉足輕重，起著重要的營養與健康平衡作用。因其適宜生長在高原冷涼的區域，具有耐寒性強、生長期短、高產早熟、適應性廣等特點，以及獨特的營養結構和保健作用，青稞已成為極具開發利用價值的高原特色農作物之一[2]。青稞產業的健康發展，對于保障青藏高原地區糧食安全、社會穩定和高原特色產業的發展具有重大意義。

青稞條紋病為種子傳播的系統性病害，病菌潛伏于種子中，成為翌年發病的菌源。控制該病害有效的方法就是使用健康良種，但受經濟發展和環境條件等的限制，目前青稞生產用種60%以上依靠農戶自留。以糧代種造成了條紋病發生逐年加重，在青海造成的年均產量損失達10%左右，嚴重的高達25%。青稞條紋病菌為真菌門子囊菌綱盤菌目盤菌科核腔菌屬麥類核腔菌Pyrenophora.graminea，傳統絲狀真菌無性階段形態相近，因此，分類鑒定主要依據真菌的孢子形態進行。青稞條紋病菌在人工培養基上較難產生分生孢子[3]，難以通過表觀形態鑒定，而rDNA-ITS序列分析使絲狀真菌的鑒定更容易且更準確[4]。rDNA-ITS包括ITS1、5.8S和ITS2的全長ITS區域序列，擁有相對豐富的信息，因而全長序列的ITS分析在真菌分子生物學鑒定中比較常用[5]。吳寬然對來自不同地理區域的菌株進行ITS序列分析，將供試菌株分為3個大類，共發現13個變異位點，15種單核苷酸多態性類型[6]。通過rDNA-ITS序列分析能揭示菌株的核苷酸變異，可以更加穩定和直接地研究菌株的遺傳分化。本研究通過對青海省不同地區青稞條紋病株進行病原菌分離、純化，基于rDNA-ITS進行條紋菌群體的遺傳多樣性分析，以期為明確該病害的發生流行規律以及制定相關防控技術體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株。供試菌株采自青海青稞主產區（表1）典型條紋病癥狀的發病葉片標樣，保存于標本夾，常溫保存。

1.1.2 供試試劑與儀器。供試試劑：瓊脂粉、葡萄糖，均購自北京索萊寶科技有限公司；DNA提取試

劑盒HP Fungal DNA Kit，購于Omega Bio-Tek科技有 限 公 司；dNTP Mixture、Loading Buffer，均 購 于TaKaRa公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 發病葉片樣品采集信息

供試儀器：TissueLyser II組織研磨儀，購自凱杰企業管理（上海）有限公司；微量核酸蛋白測定儀、sorvall ST 16R高速冷凍離心機，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀，均購自愛普拜斯應用生物系統貿易（上海）有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 培養基的配制。PDA（potato dextrose agar）培養基配制：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉18 g，加水調至1 L，121℃下滅菌20 min。

1.2.2 供試菌株分離、純化及保存。病樣沖洗處理干凈后，剪取病、健交界處的組織小段約3 mm，通過表面消毒處理（75%乙醇30 s，5%次氯酸鈉1 min），無菌水沖洗3次后，接種在PDA平板培養基上，每皿5塊病組織。各地區病樣各分離10皿，置于22℃恒溫箱中培養。待菌落長出后，先用挑針挑取上層菌絲，待菌絲長至培養皿的2/3時用手術刀切取尖端菌絲，反復純化5～7次，直至菌絲形態一致。

由本實驗室分離、純化得到的條紋病菌菌株用濾紙片法保存并驗證其活性后，于-20℃冰箱保存。

1.2.3 基因組DNA提取。對長滿培養基的各供試菌株，小心挑取菌絲于2 mL離心管中，參考DNA提取試劑盒HP Fungal DNA Kit說明書提取DNA。獲得的基因組DNA經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，同時，DNA稀釋10倍后保存于-20℃冰箱，原液保存于-80℃冰箱。

1.2.4 rDNA-ITS區間擴增及遺傳多樣性分析。利用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴增條紋病病菌rDNA-ITS區間，PCR體系為：dNTP Mixture12.5μL，引物各1μL，DNA模板2μL，添加無菌去離子水至25μL。PCR反應程序為：92℃預變性10 min；92℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環30次；72℃延伸10 min。

PCR產物經電泳后確定片段為600 bp左右，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。各菌株測序結果于GenBank比對后，經MEGA和DNAsp軟件分析病原菌群體間的遺傳分化關系。

2 結果與分析

2.1 青稞條紋病病原菌的分離及菌落形態特征

采自青海青稞主產區（42個采集地點）典型條紋病癥狀的發病葉片，經分離純化得到79株病株。培養初期菌絲白色，邊緣整齊，生長10 d后部分菌株產生白色、灰色、墨綠色和橙色等可溶性色素，導致菌落顏色多變，但均不產生分生孢子（圖1）。

2.2 青稞條紋病病原菌DNA提取及PCR產物電泳結果

提取已純化的病菌菌絲基因組總DNA經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2-a所示，其總基因組DNA條帶明亮，表明DNA質量較好。條紋病病原菌rDNA-ITS區間片段大小為600 bp左右，利用通用引物ITS1和ITS4擴增rDNA-ITS區間，取2 μL PCR產物經2%瓊脂糖電泳凝膠顯色確定，擴增片段為600 bp左右（圖2-b）。PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.3 條紋病菌遺傳多樣性分析及鄰接聚類分析

采用引物ITS1和ITS4擴增79株條紋病菌rDNA-ITS區間，其長度范圍為597～599 bp。各菌株測序結果于GenBank比對后，其中75株與麥類核腔菌Pyrenophora graminea（GenBank：KC787968.1）同源性最高為98.31%～99.49%，其他4株不確定。經MEGA 7.0.14軟件分析75株病原菌的遺傳關系。對75條rDNA-ITS序列區間，以DNAsp軟件進行群體多態性位點分析，最終確定長度為569 bp序列用于分析。

所有變異位點共定義了5個單倍型（表2），H1包含70個菌株，菌株源于青海青稞主要種植區。2個單倍型（H2和H3）菌株（DLXRD1和DLXRD2）采自海西蒙古族自治州都蘭縣香日德鎮。其余2個單倍 型（H4和H5）的 菌 株（LDMY1、LDMY2和GNSD2）分別采自海東市樂都縣馬營鄉和海南藏族自治州貴南縣森多鄉。結果表明，該段序列具有較低的遺傳多樣性水平。根據DNAsp軟件分析，得到多態位點有18個，占總位點的3.16%，其中有8個位點是因為堿基缺失造成的。這18個多態性位點中單類型多態性位點有14個，簡約性信息位點有4個，沒有3種或4種多態性位點。分析表明，Pyrenophora graminea的該段序列較為保守，突變也較為隨機，僅有點突變。

鄰接（Neighbor-Joining，NJ）聚類分析表明（圖3），75個rDNA-ITS序列聚成5支，且遺傳相似度較高（0.002～0.027）；H4（LDMY1和LDMY2）與Pyrenophora graminea（GenBank：KC787968.1）聚 為一支；H5（GNSD2）獨立聚為一支，與其他支遺傳距離距離較遠。

表2 Pyrenophora graminea 5個單倍型的ITS序列差異位點

3 討論與結論

本研究所分離純化的條紋病菌株在菌絲顏色、菌絲形態方面存在差異，且同株分離的條紋病菌在培養基上的形態多樣，但基于rDNA-ITS的測序結果表現一致。可能是控制色素和形態的基因不在rDNA-ITS區間。如需劃分生理小種，還要進一步選取其他基因序列。

rDNA-ITS區在真菌種間存在著豐富的變異，在種內卻高度保守，同時，ITS片段的進化速率是18SrDNA的10倍，這是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎[7]，已廣泛運用于植物檢疫[8-9]。本研究采樣寄主均為青稞，各菌株測序結果于GenBank比對后，其中75株與麥類核腔菌Pyrenophora graminea（GenBank：KC787968.1）同 源性最高。rDNA-ITS序列區間經DNAsp軟件進行群體多態性位點分析，所有變異位點共定義了5個單倍型，有5株菌株發生點突變，變異位點有18個，共3種變異類型。吳寬然檢測大麥條紋病菌株間ITS變異位點，共檢測到13個變異位點，15種位點變化[6]，與本研究相比，變異位點更少但變異類型更多，可能與青海特殊地理環境及本試驗樣品采集樣本的寄主均為青稞有關。其中H5（GNSD2）獨立聚為一支且變異位點較多，可能是由于其采集點的海拔最高，地理位置相對其他區域較遠引起的。單倍型多樣性（Hd）和鄰接聚類分析是評價遺傳多樣性的重要指標。根據單倍型多樣性（H）和鄰接聚類分析數據表明，所有變異位點共定義了5個單倍型，75個rDNA-ITS單倍型聚成5支，且遺傳相似度較高（0.002～0.027），與單倍型結果一致，表明該群體具有較低的遺傳多樣性水平，且遺傳多樣性與地理位置的分布無相關性。這與Bayraktar等[10]和司二靜等[4]的研究結果類似，造成該現象的原因可能與青稞條紋病為種傳病害有關。

本研究在青稞生長季節對主要種植區的條紋病采集標樣，進行病原菌分離、培養和純化，基于條紋病菌群體的rDNA-ITS序列進行群體遺傳多樣性分析及變異位點分析，明確了青海條紋病菌優勢毒性類群及其相應的差異位點。抗病育種是病害防治經濟有效的途徑，抗性評價是抗病育種的前提條件，本研究對青海條紋病優勢毒性類群進行了初步的分類，可為青海青稞品種抗性評價提供主要毒性類群。同時，本研究所分離純化的菌株培養10 d后，其生長速度、菌絲顏色和菌絲致密程度等方面均存在差異，可為生理小種的劃分提供理論依據。