南瓜色素的分離制備及其抗氧化作用

錢穎聰，胡 煒，陳天鑒，阮依莉，林藝涵，張擁軍

（中國計量大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018）

南瓜色素是從葫蘆科南瓜屬南瓜（Cucurbita moschata（Duch.ex Lam.）Duch.ex Poiret）果肉得到的黃色天然食品級色素，是一種少有的著色力強的理想天然色素，穩定性好且具有抗氧化作用，可在多種領域中得到應用[1，2]。南瓜色素主要由α-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素和葉黃素這三類類胡蘿卜素構成，這是使南瓜果肉呈現強烈的黃色或橙色的原因[3]，其中按照Bartosz Kulczynski 等對于南瓜色素的分析可知，每100 g鮮南中β-胡蘿卜素1.29～8.33 mg，葉黃素3.34～22.92 mg[4]?？芍~黃素占大多數。葉黃素因含有羥基、羰基、甲氧基或環氧化結構而極性較強，故在極性較強的有機溶劑中溶解性較大。黃愛妮等研究發現，無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯與乙醚都可以作為南瓜色素的提取劑，其中無水乙醇提取率最大[5]。目前已有關于南瓜果肉色素提取、穩定性方面的研究報道[6-10]，在南瓜色素分離純化及抗氧化性方面的研究也逐漸開展[11-13]。但現有研究大多停留在南瓜色素提取制備等方面，關于其純化、結構及定量分析方法等方面的研究鮮有報道；關于其抗氧化的研究也只涉及體外試管比色實驗，鮮有生物體內抗氧化方面的研究。基于此，本實驗首先通過比色法和高效液相色譜法建立了南瓜色素的定量測定方法，采用乙醇作為提取液，進而采用Box-Behnken Design（BBD）的試驗設計方法對超聲輔助提取南瓜色素的工藝條件進行優化，利用大孔吸附樹脂對制備的南瓜色素進行純化，并對純化后南瓜色素在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）模式生物體內的抗氧化作用進行了研究，以期為南瓜色素的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

南瓜采用黃狼南瓜購于杭州下沙物美超市，無病蟲害和腐爛，洗凈后去皮、籽、瓤并切絲，置65 ℃烘箱中烘干后粉碎，過60目篩備用；甲醇與乙腈為色譜純，購于杭州米克化工儀器有限公司；二甲基亞砜（DMSO）等化學試劑均為分析純，購于杭州米克化工儀器有限公司；大孔吸附樹脂（AB-8、D-101、DA-201、DM-301）購于東鴻化工有限公司；野生型秀麗隱桿線蟲（N2），大腸桿菌E.coliOP50，由浙江大學動物科學學院惠贈；BCA蛋白定量測定試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，丙二醛（MDA）測試盒，所有試劑盒購于南京建成科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 南瓜色素定量分析方法的建立

采用超聲輔助醇提的方法制備南瓜色素，用95%的乙醇溶液洗脫至無色，用DA-201樹脂純化后，在300～800 nm范圍內進行光譜掃描獲得最大吸收峰。參考周業豐等的方法[14]略做修改，即純化后色素，用無水乙醇配置成不同濃度的稀釋液，測定南瓜色素在可見區（446 nm）具有最大吸收，在446 nm處檢測不同濃度南瓜色素的吸光度，繪制濃度-吸光度關系曲線，線性回歸方程為：y=0.132 9x-0.009 2，R=0.994 1。南瓜色素濃度與吸光度之間存在較好的線性關系。

1.2.2 南瓜色素提取工藝單因素試驗

1.2.2.1 浸提劑濃度優化

配置濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液，在料液比1∶10，超聲30 min，溫度50 ℃，水浴震蕩40 min條件下提取。

1.2.2.2 浸提時間的優化

將水浴震蕩時間分別設置為10、20、30、40、50、60 min，在乙醇濃度100%，料液比1∶10，超聲30 min，溫度50 ℃條件下提取。

1.2.2.3 浸提料液比的優化

分別按照料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）加入無水乙醇，在超聲30 min，溫度50 ℃，水浴震蕩40 min條件下提取。

1.2.2.4 浸提溫度的優化

將浸提溫度分別設置為20、30、40、50、60、70 ℃，在乙醇濃度100%，料液比1∶10，超聲30 min，水浴震蕩40 min條件下提取。

1.2.2.5 超聲輔助時間的優化

將超聲波輔助時間分別設置為10、20、30、40、50、60 min，在乙醇濃度100%，料液比1∶10，溫度50 ℃，水浴震蕩40 min條件下提取。

1.2.3 響應面優化提取條件

根據單因素試驗的結果，確定影響南瓜色素得率最顯著的3 個因素，以南瓜色素得率為響應值，采用Box-Behnken Design（BBD）的試驗設計優化南瓜色素的提取工藝條件。

1.2.4 大孔樹脂型號的選擇

稱取活化后大孔樹脂AB-8、D-101、DA-201與DM-301，加入南瓜色素提取液，置于恒溫水浴振蕩器中進行振蕩吸附，測定最佳波長下吸光度，計算吸附率；將吸附平衡的大孔樹脂抽濾，加入無水乙醇進行水浴振蕩解吸，測定最佳波長下吸光度，計算解吸率。吸附率與解吸率計算公式參考努爾比亞·亞力坤的等的方法[15]。計算公式為：

（1）吸附率%=（初始吸光值－吸附后吸光值）/初始吸光值×100%

（2）解析率%=解吸后吸光值/（初始吸光值－吸附后吸光值）×100%。

1.2.5 大孔樹脂靜態吸附實驗

1.2.5.1 吸附解吸最佳時長

靜態吸附動力學曲線：取20 mL 南瓜提取液，向其中加入經過預處理的大孔樹脂2 g，靜態吸附，每隔30 min測定1次吸光度，持續180 min。

解吸動力學曲線：過濾達到飽和吸附的樹脂，向樹脂中加入20 mL無水乙醇，靜態解吸，每隔10 min測定一次吸光度。

1.2.5.2 樹脂與提取液的最佳比例

分別稱取0.5、1.0、1.5、2，2.5、3、3.5、4.0 g處理好的最優型號樹脂，各加入20 mL南瓜色素提取液，靜置最優時長后，測定各吸附液的吸光度。

1.2.5.3 樹脂與提取液的最佳pH值取7 份20 mL 南瓜色素粗提液，分別加入1 g 最優型號樹脂。pH 值分別調為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0（HCl或NaOH調節），靜態吸附最優時長后，在最優波長下測定吸光度。

1.2.6 大孔樹脂動態實驗取已吸附南瓜色素的樹脂10 g，裝入25×200 mm的色譜柱，用蒸餾水洗脫8個柱體積后，再用無水乙醇洗脫至洗脫液無色，流速為1.0 mL/min，測定每份收集液的吸光度，確定洗脫劑用量。

1.2.7 線蟲體內抗氧化指標檢測。

C.elegans經同步化培養后使用，實驗設DMSO空白對照組、VE陽性對照組與不同濃度樣品組（12.5、25、50 μmol/L）。同步化線蟲挑至含大腸桿菌OP50的NGM培養基，樣品處理6 h后，制備線蟲均漿，采用試劑盒法檢測線蟲體內總超氧化物歧化酶活力（T-SOD）和丙二醛（MDA）水平。

1.2.8 數據處理

試驗數據均以Means±SD表示，使用IBM SPSS Statistics 22 進行顯著性分析（P＜0.0.5）。

2 結果與分析

2.1 南瓜色素的提取工藝優化

2.1.1 南瓜色素超聲提取的單因素試驗

2.1.1.1 乙醇濃度的優化

乙醇濃度對南瓜色素得率的影響較大。隨乙醇濃度增加，南瓜色素得率快速上升，濃度增加至95%時，色素得率趨于平緩，故選擇95%乙醇作為浸提劑濃度。

2.1.1.2 超聲時間、料液比、浸提溫度、浸提時間的優化

超聲時間、料液比、浸提溫度、浸提時間對南瓜色素得率的影響見圖1。由圖1（A），隨著超聲時間的延長，南瓜色素得率出現先升后降的趨勢，可能是超聲過長破壞南瓜色素導致[3]。超聲40 min時得率最大，故選擇40 min作為響應面優化的中心水平。由圖1（B），隨著料液比的增加，色素得率快速上升，隨著趨于平緩并有下降趨勢，其原因可能是隨著料液比的增大，單位體積提取劑中對南瓜色素的溶解量已基本飽和，南瓜色素向浸提劑的擴散達到平衡，導致南瓜色素不能充分溶出[16]。料液比1∶40時得率最大，故選擇1∶40作為響應面優化的中心水平。

由圖1（C），溫度為40 ℃時得率最高，原因是溫度過高使南瓜色素降解導致[17]，故選擇40 ℃作為最佳提取溫度。由圖1（D），隨著浸提時間的延長，南瓜色素得率出現先降后升再降的趨勢，浸提60 min時色素得率最高，隨后下降可能是隨著時間的延長，南瓜色素被氧化所致，故選擇60 min作為響應面優化的中心水平。

圖1 超聲條件對南瓜色素得率的影響Figure 1 The effect of ultrasonic condition on yield of pumpkin pigment

2.1.2 響應面優化南瓜色素的提取工藝條件

根據南瓜色素提取的單因素試驗，確定3 因素3 水平為料液比1∶10、1∶40、1∶70，浸提時間40、60、80 min，超聲時間20、40、60 min。通過Design-expert 8.0.6數據處理軟件的Box-Behnken Design（BBD）的試驗設計原理，以南瓜色素得率為響應值，試驗設計與結果見表1，可獲得3個因素與響應值間的回歸方程，如下：

Y=-0.28A2+0.084B2-0.51C2+0.11AB-0.11AC-0.009BC+0.035A+0.049B+0.9C+6.27

回歸方程中，Y表示南瓜色素得率的預測值，A、B與C分別代表超聲時間、浸提時間與料液比的自變量，對回歸方程系數分析結果見表2。對回歸模型進行方差分析，影響南瓜色素得率的順序為料液比＞浸提時間＞超聲時間。相關系數R2（決定系數）與R2Adj（調節決定系數）分別為0.942 4與0.868 2，表明預測值與觀測值間具有較高相關性。同時，較低的變異系數（C.V.%3.67）表明高度的可靠性與精密度。P用于檢測每個系數的顯著性，其中模型的P=0.001 5，說明模型適應性非常顯著該模型的擬合度好，可以真實地描述各個影響因子與響應值之間的關系。同時，失擬項（0.131 3）不顯著，說明回歸方程與實際情況吻合較好，實驗誤差小。

表1 南瓜色素提取的BBD設計及響應值Table 1 BBD design and response value of pumpkin pigment extraction

表2 響應面二次型方差分析Table 2 Response surface quadratic analysis of variance

由實驗結果做響應面圖，見圖2，可看出各因素在南瓜色素得率過程中的相互作用，從而確定合適的配比參數。預測的配比參數為：超聲時間41.56 min、浸提時間80 min、料液比1∶66.14，該條件下南瓜色素得率理論值為6.74 mg/g。為了驗證模型預測的準確性，實驗對預測參數進行了驗證，參數調整為：超聲時間42 min、浸提時間80 min、料液比1∶66。經過3組平行實驗，實驗南瓜色素得率為6.760±0.005 mg/g，與預測理論值無顯著性差異，響應面優化真實可靠。

2.2 南瓜色素純化工藝的選擇

2.2.1 大孔樹脂型號的選擇

由表3可知，AB-8的吸附率最優，其次為D-101，而解吸率相較其他型號較差。樹脂的選擇需同時考慮吸附率和解吸率，其中AB-8是常用的大孔樹脂，價格低廉，因此綜合考慮之后選取AB-8。

圖2 自變量間的交互作用對南瓜色素得率的影響Figure 2 The effect of interaction among variables on the yield of pumpkin pigment

表3 不同型號大孔樹脂的解吸率和吸附率Table 3 Desorption and adsorption rates of different types of macroporous resins

2.2.2 靜態吸附解吸時長的選擇

由圖3（A），靜態吸附時隨著時間增加，得率逐漸降低，在150 min后趨于穩定，因此靜態吸附的最佳時間是150 min。由圖3（B），靜態解吸時吸光度隨時間增加得率升高，50 min后趨于平緩，故解吸的最佳時間為50 min。相較于努爾·亞力坤等的研究結果[15]，由于樹脂型號的不同，AB-8對于南瓜色素吸附解吸的時長比D-101短。

圖3 靜態吸附解吸時長對南瓜色素的影響Figure 3 The effect of static adsorption and desorption time on pumpkin pigment

2.2.3 料液比的選擇

由圖4可知，在每200 mL乙醇中樹脂質量達到2.5 g時被吸附的色素提取液得率趨于穩定，所以較優的樹脂與色素提取液比例為1∶8（g/mL）。

2.2.4 洗脫劑的選擇由表4，解吸時最優洗脫劑為乙酸乙酯，其次為丙酮，由于各文獻中樹脂型號選擇不同，洗脫劑有所不同，出于安全考慮，后期實驗采用乙醇作為洗脫劑。

圖4 樹脂用量對南瓜色素得率影響Figure 4 The effect of resin dosage on the yield of pumpkin pigment

表4 不同洗脫劑對南瓜色素解吸的影響Table 4 Effect of different eluents on the desorption of pumpkin pigment

2.2.5 pH值的選擇

實驗發現南瓜色素在堿性條件變渾濁，有文獻報道類胡蘿卜素在高堿性環境中不穩定[18]，可見南瓜色素不適用于堿性條件。由圖5（A），酸性和中性條件下，AB-8大孔樹脂對南瓜色素的吸附隨著pH值呈現先升后降趨勢，可能是由于色素內含有羧基（-COOH）呈現酸性的原因[19]。不同pH值條件下的吸附效果相差不大，且強酸性條件下色素的得率有所下降，說明色素在強酸性條件下被降解。故選取pH值為7。

2.2.6 洗脫劑用量的選擇

由圖5（B），得率隨洗脫劑用量的增加先升高后降低，洗脫劑用量為6 倍洗脫體積（BV）時，達到峰值。18 BV以后得率趨于平穩，色素基本全部被洗脫出來，故洗脫劑的最佳用量為18 BV。

綜上，在最佳純化條件下，即選取AB-8樹脂，樹脂與溶劑最佳比例為1∶8（g/mL），吸附洗脫劑的最佳用量為18 倍柱體積，此時南瓜色素的得率為9.5%。在此條件下分離制備南瓜色素，進行后續的抗氧化能力研究。

圖5 pH和洗脫劑用量對南瓜色素得率影響Figure 5 The effect of pH and the amount of eluent on the yield of pumpkin pigment

2.3 南瓜色素對C. elegans體內總超氧化物歧化酶（T-SOD）與MDA活性的影響

SOD是機體重要的抗氧化酶，可清除超氧陰離子自由基。由圖6（A），隨著南瓜色素濃度升高，線蟲體內T-SOD 活性呈現先升后降現象，色素濃度為25 mg/mL 時，SOD 活性顯著高于空白對照組（P＜0.05）。在50 mg/mL抗氧化活性大幅降低且僅稍好于對照，主要原因可能有兩方面的原因，一是濃度過高會產生其它生理毒性，反而影響了線蟲的正常生理活動[20]，二是可能是滲透壓過高造成的[21]。由圖6（B），與空白對照組比較，不同濃度的南瓜色素，均可以使線蟲體內MDA 水平顯著下降（P＜0.05），且與陽性對照VE間無差異（P＞0.05）。MDA作為脂質氧化終產物，其含量越大表明機體氧化損傷越嚴重[22]。

圖6 南瓜色素對C.elegans體內總超氧化物歧化酶（T-SOD）與MDA活性的影響Figure 6 The effect of pumpkin pigment on T-SOD and MDA level activity in C.elegans

3 結論

南瓜色素是一種安全性高，著色力強的天然色素，同時又是一種非常重要生物抗氧化劑。南瓜色素的提取方法主要有傳統的溶劑提取法（提取南瓜色素較普遍方法，包含固液萃取法、回流法、煎煮法等）、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法以及超臨界二氧化碳萃取法等。其中，超聲波輔助提取法具有減少耗時、效率高、能耗低、可低溫下操作等優點近年來倍受關注。我們采用超聲波輔助提取南瓜色素時發現，隨著超聲時間延長、溫度升高，南瓜色素的得率出現先上升后下降的趨勢，這主要是因為超聲時間過長[3]，溫度過高[17]，都會導致南瓜色素被破壞。而隨著浸提時間的延長，得率卻呈現先降后升的趨勢，這可能是由于南瓜色素被氧化造成的。隨著料液比的增大，南瓜色素得率的趨勢上升后趨向平衡，這主要是因為單位體積提取劑中南瓜色素的溶解量已經基本飽和[16]。本實驗采用單因素試驗和Box-Behnken Design（BBD）的試驗設計得出95%乙醇為浸提劑、超聲時間42 min、浸提時間80 min、料液比1∶66時，南瓜色素溶出效果最佳，南瓜色素得率達6.760±0.005 mg/g。

南瓜色素的純化方法主要采用吸附柱層析法，常用的吸附劑主要為大孔吸附樹脂、氧化鋁等。我們對不同極性的大孔樹脂進行了篩選，實驗結果與王瑩[11]等的研究結果不同，可能是由于使用的南瓜品種不同，其中的南瓜色素的種類與極性不同所致?？紤]南瓜色素（主要為葉黃素類的類胡蘿卜素）的極性特點，我們選取了非極性與弱極性樹脂進行純化。吸附率最高的是AB-8，但解析率不高，文獻中用丙酮作為溶劑，解析率較高；考慮到食用安全性，實驗選擇了乙醇進行洗脫。

南瓜色素是一種含有共軛雙鍵系的萜烯基團類天然色素，它能夠影響細胞生長調節，調節基因表達和免疫反應。近年來，對于花青素等水溶性天然色素的抗氧化性研究較多，而目前對于南瓜色素的抗氧化能力作用尚不明確，可通過體內體外實驗探討其作用機制，體外實驗包括羥自由基（·OH）、DPPH 自由基（DPPH·）清除能力等，體內實驗可選用秀麗隱桿線蟲（C.elegans）、大鼠及小鼠作為模式實驗。其中秀麗隱桿線蟲因具有結構簡單、繁殖量大、方便觀察等特點備受關注，且大多與人體病癥有關的基因和通路涵蓋在線蟲基因組中。在秀麗隱桿線蟲上進行對南瓜色素抗氧化性的研究，便于觀察，應用線蟲模型做的研究結果也可以外推到人類。本文南瓜色素抗氧化活性體內實驗中，隨著南瓜色素濃度升高，線蟲體內SOD活性呈現先升后降現象，可能原因是濃度過高會產生其它生理毒性[20]，反而影響了線蟲的正常生理活動，或是高濃度產生的高滲透壓所致[21]。而不同濃度的南瓜色素，均可以使線蟲體內MDA水平顯著下降（P＜0.05），使機體抗氧化能力提高。

目前對南瓜色素的高效制備仍在起步階段，抗氧化性研究也多停留在體外試管比色實驗。獲得高得率高純度的南瓜色素，解吸其分子結構、探討其抗氧化應激作用的機制及結構與活性間的構效關系等是目前亟待解決的問題。