乳腺病變剪切波彈性模量與病理基礎的相關性研究

廉祎，黃瑛

中國醫科大學附屬盛京醫院 超聲科，遼寧 沈陽 110004

引言

乳腺癌具有較高的發病率和死亡率，在女性因癌癥導致的死亡率中，乳腺癌居第一位，嚴重威脅著女性的健康[1]。超聲檢查是乳腺疾病最常用的影像學檢查方法，近年來彈性成像的應用，使得常規超聲對乳腺病變的診斷特異性有了一定的提升[2-4]。剪切波彈性成像（Shear Wave Elastrography，SWE）作為彈性成像方式中應用較廣泛的一種，對于軟組織彈性的顯示有著定量、可視化且實時顯示的優點[5]，其在乳腺良惡性病變的鑒別中有著重要的價值[6]。大多數乳腺惡性病變的硬度明顯高于良性病變[7]，但惡性病變硬度高于良性病變的具體原因還未明確。腫瘤的生長是一個復雜的過程，乳腺病變的硬度也不會只與單一的因素相關，與病變中的細胞數量、膠原纖維的含量，組織學上的特點等都可能具有相關性。找到乳腺病變硬度的相關因素，就更容易理解硬度在臨床應用中的價值。本實驗擬應用SWE技術對乳腺穿刺患者病變的彈性模量值進行測量，穿刺后對標本進行常規HE染色做出病理診斷及統計細胞總數、Masson染色測定膠原纖維的含量、血管內皮細胞生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）[8]免疫組化染色估算血管密度。應用統計學的方法分析各個因素與剪切波彈性模量的相關性，探究乳腺病灶硬度產生的原因，豐富硬度在臨床應用中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2018年9月至2019年3月來中國醫科大學附屬盛京醫院接受超聲引導下乳腺結節粗針穿刺的患者42例（經GPower3.1軟件估算樣本量），術前均行常規超聲檢查及剪切波彈性成像檢查，術后對所有患者的穿刺病理標本進行HE染色做出病理診斷并計數細胞數量，同時對切片進行Masson染色及VEGF免疫組化染色，患者年齡20～86歲，平均（45.9±15.9）歲。病灶最大徑0.6～5.8 cm，平均（2.6±1.3） cm。患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與方法

剪切波彈性成像檢測：選用SuperSonic Imagine公司AixPlorer超聲診斷儀，探頭頻率4～15 MHz。常規超聲檢查結束后切換到剪切波彈性成像檢查的模式，在測量剪切波彈性模量值時要避免外界的壓力，囑患者屏住呼吸幾秒鐘并保持安靜。質控的標準是感興趣區上方呈均一的藍色，表示沒有外界的壓力，為使感興趣區上方呈均一的藍色，我們可以通過輕提探頭來實現，當感興趣區上方出現其他顏色時，輕提探頭調整此部位的壓力，靜置3 s，使圖像穩定后，定幀，橫縱切面各存三張圖。之后用Sonic軟件分析，點擊Q-BOXratio或Trace鍵，手動定義感興趣區，用直徑為2 mm大的感興趣區先后選取病灶內最硬的部位及病灶旁邊正常的乳腺組織，由系統自動計算出該感興趣區的彈性模量最大值、平均值、最小值及病灶與周圍組織比值，每個病灶進行6次測量，最后記錄6次測量結果的平均值。

病灶內細胞數量測定：將乳腺組織包埋，切片，脫蠟至水，行HE染色，脫水，透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。Image-ProPlus6.0圖像處理軟件進行定量分析，在高倍鏡（×400）下，按照隨機選取的方式在每一張細胞切片上選定5個視野，計算每一視野中細胞的總數，計算平均值。

病灶內膠原纖維含量測定：將切片脫蠟至水，行Masson染色，脫水，透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。鏡下膠原纖維呈藍色；紅細胞、胞質、纖維素等呈紅色；細胞核呈藍褐色。對膠原纖維的定量分析：Image-ProPlus6.0圖像處理軟件進行定量分析，在高倍鏡（×400）下，按照隨機選取的方式在每一張細胞切片上選定5個視野，計算每一視野中膠原纖維累加面積，計算平均值。

病灶內VEGF表達水平測定：將切片脫蠟至水，行VEGF免疫組化染色，脫水，透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。細胞內若出現棕黃色顆粒則定義為陽性細胞，將陽性細胞所占的百分比和顯色強度結合評分。在高倍鏡（×400）下，按照隨機選取的方式在每一張細胞切片上選定5個視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞所占百分比。陽性細胞所占比例≥75%為4分；50%～75%為3分；25%～50%為2分；1%～25%為1分；＜1%為0分。顯色強度評分：棕褐色為3分；黃色至棕黃色為2分；淺黃色為1分；無著色為0分。兩種評分結果相乘，得出VEGF的表達水平[8]，乘積≤1分定義為陰性表達，＞1分定義為陽性表達。

以上染色結果的判定，由病理科2名醫師共同完成，工作時對患者乳腺病變的SWE結果均不了解。

1.3 統計學方法

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以均±值標準差（±s）表示，惡性組及良性組病灶的彈性模量、細胞數目、膠原纖維面積及VEGF的表達水平比較采用t檢驗，彈性模量與細胞數目、膠原纖維含量及VEGF表達水平的相關性采用Pearson相關性分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 良惡性乳腺病變的彈性模量值

在42例乳腺病變中，惡性病變23例（54.7%），良性病變19例（45.3%）。乳腺惡性病變彈性模量最大值、平均值、最小值及病灶與周圍組織比值分別（143.56±69.41）、（119.97±66.25）、（84.75±58.51） kPa 及（12.03±7.71）明顯高于良性病變的（50.1±26.91）、（38.18±22.53）、（25.81±18.85） kPa及（3.50±3.19）（t=5.526、5.133、4.206、4.503，P＜0.001），見表 1。

表1 良惡性乳腺病變的彈性模量值對比

2.2 良惡性乳腺病變彈性模量值與病理基礎的相關性分析

惡性病變中的細胞數目（502.57±167.698）個，明顯小于良性病變中的細胞數目（838.11±211.886）個（t=5.371，P＜0.01）。彈性模量最大值與細胞數目呈線性負相關（r=-0.630，P＜0.01）。惡性病變中膠原纖維的面積（70114.69±13678.26） μm2明顯大于良性病變中膠原纖維的面積（47022.47±15051.32） μm2（t=5.156，P＜0.01），彈性模量最大值與膠原纖維含量呈線性正相關（r=0.646，P＜0.01）。在23例惡性病例中VEGF陽性表達率為82.61%（19/23），在19例乳腺良性疾病中VEGF陽性表達率為15.8%（3/19）。VEGF蛋白在乳腺惡性病變中表達明顯高于乳腺良性病變（P＜0.05）。在VEGF蛋白表達陽性的病例中進行Pearson相關分析，彈性模量最大值、平均值、最小值及比值均與VEGF蛋白表達無明顯相關關系（圖1～3）。

圖1 乳腺浸潤性導管癌腫塊的病理圖

圖2 乳腺腺病腫塊的病理圖片

圖3 乳腺病變剪切波彈性模量最大值與病理基礎相關性的散點圖

3 討論

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤[9]，早期發現、早期診斷尤為重要。在超聲診斷中，硬度的增加在惡性病變與良性病變的鑒別中有著重要的輔助價值[10-11]。本研究通過對乳腺病變剪切波彈性模量值的定量分析發現，乳腺惡性病變的彈性模量最大值、平均值、最小值、病灶與周圍組織彈性模量比值均高于良性病變，與先前其他學者的研究結果大致相符[6,12-14]，證實了剪切波彈性成像在乳腺良惡性病變鑒別中的重要作用。

為探究硬度產生的原因，本研究對乳腺病變的彈性模量值與病變內細胞數量，膠原纖維含量，血管內皮細胞生長因子表達水平進行相關性分析，發現乳腺病變的彈性模量值與病變中細胞的數量呈負相關，與膠原纖維的含量呈正相關，與血管內皮細胞生長因子表達無明顯相關關系。證明了乳腺病變硬度與膠原纖維含量之間密切的相關關系，膠原纖維作為構成乳腺惡性病變細胞外基質纖維成分中含量最多的成分，其不僅在構成細胞外基質的主要骨架[15]，增加腫塊的硬度，支撐腫塊維持一定形態中具有關鍵作用，研究表明其在腫瘤的生長，侵襲等生物學行為中也發揮著重要的作用[16]。Levental等[17]發現乳腺惡性病變形成的過程中，膠原纖維的表達逐漸增加，細胞外基質的硬度也逐漸變大。實際上，其硬度對細胞的生長、轉移有著促進的作用[18]。我們發現病變內細胞數目的增多對乳腺病變硬度的增加無正向作用，也從側面證明了乳腺病變的硬度主要由間質成分的硬度決定。本研究也證實了惡性病變與良性病變相比含有更多的膠原纖維，所以我們認為乳腺惡性病變硬度增加的病理基礎很有可能是膠原纖維的增多，這也可以與惡性腫瘤生長、侵襲的生物學行為相聯系，將硬度增加與惡性病變的病理基礎建立聯系，使我們更容易理解乳腺病變硬度在臨床應用中的價值。

有研究還發現乳腺病變的硬度和某些促進膠原纖維表達等的細胞因子也有緊密的聯系。Xue等[19]發現乳腺惡性病變中膠原纖維含量及整合素相互作用蛋白（Kindlin-2）的平均表達強度均高于乳腺良性病變，Kindlin-2表達和Emax有相關性并且Kindlin-2和淋巴結的轉移有相關性，對于乳腺癌的進展和轉移有促進作用。彈性成像可以輔助診斷乳腺惡性病變是否伴有腋下淋巴結的轉移[20]，對于乳腺惡性病變的分級及對患者的預后判定都有著重要的意義。李萬[21]研究發現乳腺惡性病變內轉化生長因子-β1（Transforming Growth Factor β1，TGF-β1）呈高表達，且TGF-β1和膠原纖維含量呈正相關，提示膠原纖維的合成及分泌受TGF-β1的促進。病變的硬度評分也與TGF-β1表達、膠原纖維含量成正相關關系。TGF-β1已被證實可以用作預測乳腺癌患者預后不良的獨立預后因子，所以認為硬度的增加也可作為診斷及判斷乳腺癌患者預后的因素，將硬度與膠原纖維及與乳腺癌預后相關的細胞因子建立聯系，使得硬度在良惡性的鑒別中具有更可靠的依據和更廣泛的應用。越來越多的研究證明乳腺病變的彈性成像與病理基礎之間具有相關性[22]，乳腺惡性病變的硬度與其分級、惡性程度、預后等都具有相關性。

4 結論

乳腺病變剪切波彈性模量與病變內膠原纖維含量密切相關，且膠原纖維作為細胞骨架在乳腺癌的疾病發展中扮演重要的角色，這使我們更容易理解硬度在臨床應用中的價值，為剪切波彈性模量與乳腺癌的進展、淋巴結轉移，預后推測等方面的聯系提供一定的幫助。