雞樹突狀細胞的間接免疫熒光制片方法比較

何靜怡，舒鼎銘，林楚曉，李 瑩，王 艷，羅成龍

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所/畜禽育種國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部家禽遺傳育種重點實驗室/廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】樹突狀細胞因其成熟細胞具有樹突狀或偽足樣的突起而被命名[1]。作為最重要抗原呈遞細胞，樹突狀細胞是機體內(nèi)啟動特異性免疫應答的關鍵，其免疫熒光定位和功能研究一直是國內(nèi)外細胞免疫學研究的熱點之一。近幾年，免疫熒光技術和激光共聚焦掃描顯微鏡（laser scanning confocal microscopy, LSCM）分別被廣泛應用，學者們找到研究樹突狀細胞的技術突破。免疫熒光技術是目前綜合細胞形態(tài)、熒光定量、蛋白定位、免疫功能等研究的最強檢測工具，通過觀察蛋白上激發(fā)特異性標記的熒光，可直觀顯示其在細胞中的位置，有助于揭示病原在抗原定位和蛋白質(zhì)功能等方面的特征[2]。激光掃描共聚焦顯微鏡作為近代生物醫(yī)學圖像分析儀器的重要發(fā)展之一，是目前應用最廣泛和光學圖像分辨率最高的分子細胞生物學分析儀器[3]，僅檢測反射自焦平面的光線部分，大大提高了圖像的分辨率和對比度，使細胞形態(tài)和結構更精準。兩者聯(lián)合既進一步提高研究樹突狀細胞生物學的實驗技術和方法，又為細胞生物學研究提供更廣闊的前景。

【前人研究進展】細胞爬片是根據(jù)細胞對玻璃或塑料的黏附力特點建立的，是觀察細胞形態(tài)結構最常用的一種試驗手段，一般把細胞接種在裝有蓋玻片的孔板中，待在玻片上貼壁生長后再進行后續(xù)的普通染色或免疫試驗。已有學者利用細胞爬片進行體外試驗，對細胞進行各種干預處理，被應用于觀察細胞形態(tài)和蛋白分布情況[4-5]。而細胞滴片是細胞懸液離心滴片經(jīng)甲醛固定所成，大多應用于觀察胞內(nèi)不同時期蛋白表達變化的一種試驗手段，如常用的血涂片、動物口腔或腹腔洗液滴片[6]等。國內(nèi)對于兩種制片方法的對比研究最早在1979年張?zhí)N芬等[7]觀察巨噬細胞吞噬功能的方法比較試驗中。近年制片方法的對比研究在不斷創(chuàng)新和進步，如李紅軍等[8]從免疫組化的角度對比分析貼壁細胞不同制片方法。

【本研究切入點】目前實驗標本大多為組織切片[9-10]、活細胞培養(yǎng)瓶皿，而本研究針對細胞進行制片。懸浮細胞一般常用細胞滴片，貼壁細胞則用細胞爬片[11-13]，而樹突狀細胞是一種介于懸浮和貼壁狀態(tài)的半懸浮細胞。普通光學制片無法保持樹突狀細胞的形態(tài)和特點，而且LSCM較少應用于樹突狀細胞的動態(tài)蛋白標記研究中，也很少學者深入探討更能準確有效地提高實驗效率的制片方法。【擬解決的關鍵問題】本研究以雞胚為素材，經(jīng)原代分離定向誘導分化培養(yǎng)獲得骨髓源雞樹突狀細胞，分別制作細胞爬片和細胞滴片，選取具體表性的內(nèi)源性蛋白ROBO2（Roundabout）和外源性蛋白NDV（newcastle disease virus），利用細胞免疫熒光技術和LSCM檢測分析技術，多方位對比分析兩種制片方法，為后續(xù)深入解析雞胚細胞中免疫熒光定位以及蛋白功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

30枚雞胚（19日胚齡），由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所提供。

主要試劑：chicken GM-CSF和chicken IL-4（KINGFISHER BIOTECH，美國），澳洲血源胎牛血清（FBS）、RPMI1640、胰酶和青鏈霉素抗生素（GIBCO，美國），4%多聚甲醛、TritonX-100、胎牛血清蛋白（上海生物工程股份有限公司），抗熒光淬滅封片液（上海碧云天生物技術有限公司）。新城疫病毒lasota株（廣東永順生物制藥股份有限公司），小鼠抗人ROBO2單克隆抗體（08253-4G5）（SIGMA-ALORICH），雞源NDV單克隆抗體（北京天之泰生物科技有限公司），羊抗小鼠IgGⅡ抗926-68070（LI-COR，美國），羊抗雞IgYⅡ抗SA5-10070（THERMO，美國），DAPI染液（ROCHE，瑞士）。

主要儀器和耗材：倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本），LSM7100激光共聚焦掃描顯微鏡（CARL-ZEISS，德國），無菌直徑14 mm細胞玻片（上海臥宏生物公司），免疫熒光筆（CIRISC，日本），細胞培養(yǎng)相關耗材（THERMO，美國）。

1.2 試驗方法

種蛋孵化及試驗操作均在畜禽育種國家重點實驗室內(nèi)進行，孵化溫度37（±0.5）℃，濕度45（±1）%。所有操作符合動物科學實驗倫理要求。

1.2.1 雞胚骨髓源細胞原代分離 取出30枚胚蛋，分離雞胚脛骨、股骨，沖洗骨髓，收集組織液，1 000 r/min離心5 min；用含GM-CSF和IL-4 的10%FBS RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸沉淀。

1.2.2 雞樹突狀細胞滴片制作 將細胞懸液接種到24孔板中，于39 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)6 d后，胰酶消化，收集原代雞骨髓源樹突狀細胞，以5×105個/mL分裝4管，100MOI NDV接毒15 min，設陰性對照，3個重復，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用免疫熒光筆在24孔圓形玻片邊沿畫密封圈，面朝上放入24孔板。細胞懸液滴入蓋玻片圈內(nèi)，靜置10 min，使其粘附完成制片。

1.2.3 雞樹突狀細胞爬片制作 將細胞懸液接種到24孔板圓形玻片，讓其在玻片表面貼壁生長，于39 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分化6 d后將原代雞骨髓源樹突狀細胞分成3組，每組設3孔100MOI NDV（接毒15 min）、1孔陰性對照。PBS洗板3次完成制片。

1.2.4 兩種方法制片效果的比較 利用細胞免疫熒光技術和LSCM檢測對比分析兩種制片方法。

（1）免疫熒光試驗程序：用預冷的4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次；再經(jīng)預冷的0.2%TritonX-100透化10 min，PBS漂洗3次；加入現(xiàn)配的5%BSA室溫封閉1 h。

（2）雙抗體孵育：取10 cm細胞培養(yǎng)皿依次放入標記紙、封口膜、抗體24孔玻片，制作孵育板。雞源NDV抗體與ROBO2抗體按1∶2混合配制，小鼠源ROBO2單克隆抗體稀釋度為1∶50，雞源NDV抗體稀釋度為1∶25，混合抗體，將細胞面與抗體充分接觸，4 ℃ 孵育過夜；PBS漂洗3次；羊抗小鼠Ⅱ抗標記ROBO2、羊抗雞Ⅱ抗標記NDV，稀釋度為1∶200。小鼠Ⅱ抗和雞Ⅱ抗以1∶1混合避光室溫放置1 h；避光清洗3次；DAPI（1 μg/mL）染液室溫下避光標記細胞核5 min，PBS漂洗3次；將抗熒光淬滅封片液（3 μL/片）滴至載玻片，取滴片/爬片倒扣封片，4 ℃避光保存，24 h內(nèi)觀察。

（3）激光共聚焦掃描法：以波長340、488、680 nm激發(fā)檢測，NDV、ROBO2、DAPI依次顯示為綠光、紅光、藍光。用63倍油浸物鏡（數(shù)值孔徑1.25）觀察兩種類型玻片，用LSM7100 ZEN2010軟件捕捉和分析圖像數(shù)據(jù)后進行對比分析。

（4）免疫熒光定量分析：根據(jù)捕捉的圖像數(shù)據(jù)，按照抗體免疫熒光強度和顯色特點，將免疫反應性分級為單陽性、陰性，以及兩抗體熒光疊加時的雙陽性。用Excel統(tǒng)計每個視野下各指標的百分比，結果用平均值±標準差表示。所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件處理，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 成熟雞樹突狀細胞

根據(jù)雞樹突狀細胞的鑒定標準[14]，對培養(yǎng)獲得的細胞進行細胞形態(tài)學觀察。如圖1所示，原代分離的細胞經(jīng)定向誘導培養(yǎng)，接種NDV后所得細胞體積增大，伸出呈樹突狀的突起或偽足，說明獲得了成熟的樹突狀細胞。

圖1 樹突狀細胞顯微鏡檢結果 （×10 ）Fig. 1 Microscopy of dendritic cells （×10）

2.2 兩種玻片ROBO2抗體共聚焦掃描結果比較

通過熒光標記ROBO2，統(tǒng)計免疫反應分級百分比，對滴片法與爬片法的抗體免疫反應性進行定量差異性分析，結果（圖2）顯示，滴片法與爬片法的ROBO2單陽性率分別為93.73%和0.00%，陰性率分別為4.97%和72.22%，均存在極顯著差異。

圖2 ROBO2免疫反應性結果Fig. 2 Immunoreactivity result of ROBO2

雙抗體共孵育時，滴片法的ROBO2單陽性率比爬片法高，而陰性率爬片法較高，比較發(fā)現(xiàn)滴片法樹突狀細胞的ROBO2顯色性更強。根據(jù)激光共聚焦掃描結果（圖3），對比兩種制片法已標記的ROBO2，均有明亮的紅色熒光。說明滴片法比爬片法更有利于ROBO2抗體標記。

圖3 ROBO2激光共聚焦顯微鏡檢結果（×63）Fig. 3 LSCM result of ROBO2（×63）

2.3 兩種玻片NDV抗體共聚焦掃描結果比較

通過熒光標記NDV，統(tǒng)計免疫反應分級百分比，對滴片法與爬片法的抗體免疫反應性進行差異性分析，結果（圖4）顯示，滴片法與爬片法的NDV單陽性率分別為61.50%和1.51%，陰性率分別為32.60%和70.70%，均存在顯著差異。

圖4 NDV免疫反應性結果Fig. 4 Immunoreactivity result of NDV

雙抗體共孵育時，滴片法的NDV單陽性率比爬片法高，而陰性率爬片法略高，比較發(fā)現(xiàn)滴片法樹突狀細胞的NDV顯色性更強。根據(jù)激光共聚焦掃描結果（圖5），對比兩種制片法已標記的NDV，均有明亮的綠色熒光。說明滴片法比爬片法更有利于NDV抗體標記。

圖5 NDV激光共聚焦顯微鏡檢結果（×63 ）Fig. 5 LSCM result of NDV （×63）

2.4 兩種玻片雙抗體共聚焦掃描結果比較

從熒光反應性差異性分析結果（圖2和圖4）可知，滴片法與爬片法雙陽性率分別為0.46%和27.78%，差異顯著。爬片法雙陽性率比滴片法高，說明爬片法利于雙抗體的孵育。如圖6所示，滴片顯示出ROBO2和NDV相對應的紅色和綠色熒光，而爬片兩蛋白顯色重疊，顯示出明亮的黃色熒光。

圖6 雙抗體激光共聚焦顯微鏡檢結果（×63）Fig. 6 LSCM result of two antibodies （×63）

3 討論

目前，細胞培養(yǎng)應用廣泛，而免疫組織化學是顯示抗原定位的良好手段，兩種技術結合為醫(yī)藥衛(wèi)生研究[15]以及畜禽病致病機理研究提供了有效的研究手段。制作良好的熒光玻片，各個環(huán)節(jié)都非常重要。細胞滴片制作過程，細胞消化和計數(shù)等繁瑣且耗時長；細胞爬片制作則直接接種于玻片上，無需消化，操作簡單，始終保持細胞原有的細胞生物學形態(tài)，這對細胞蛋白定位的研究尤為重要。此外，細胞滴片是細胞粘附玻片，其附著力不及直接貼壁生長的爬片細胞，間接免疫熒光程序的加樣和清洗玻片，導致細胞碎片和細胞數(shù)目損耗增多。本研究稍改進試驗方法，使樹突狀細胞更高效地標記上抗體，滴片孵育試劑直接滴入所畫免疫圈內(nèi)，使玻片細胞面充分接觸試劑；細胞爬片需制作簡易孵育膜倒扣孵育，要求技術操作熟練，以減少玻片破碎的可能。

本試驗探索制片方法對蛋白免疫熒光顯示的影響，為樹突狀細胞蛋白研究提供標本制作的選擇依據(jù)。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，細胞滴片和細胞爬片的NDV和ROBO2單陽性率及陰性率分別存在極顯著差異；對于單一蛋白，細胞滴片免疫反應性優(yōu)于細胞爬片；兩種制片法雙陽性存在熒光反應性差異顯著。結合激光共聚焦掃描結果分析，細胞滴片樹突狀細胞顯示出NDV和ROBO2蛋白對應紅色和綠色熒光，而細胞爬片顯示兩蛋白熒光重疊的黃光，提示進行兩種蛋白研究時，爬片法優(yōu)于滴片法。滴片法利于抗體熒光顯色，而爬片法利于兩抗體熒光重疊。激光掃描共聚焦顯微鏡具有高分辨率、高清晰度成像，三維重建及動態(tài)觀察的特點，在進行高效細胞計數(shù)的同時進行圖像處理，并對黏附生長的單個細胞或細胞群胞內(nèi)外的熒光作定量、定性、及時動態(tài)分析[16]。動態(tài)研究必須依賴于活細胞基礎[17]。現(xiàn)今中外已普遍應用激光共聚焦掃描動態(tài)觀察細胞內(nèi)不同的化學組分[18-21]，但目前較少應用于樹突狀細胞的動態(tài)蛋白標記研究中。細胞滴片和細胞爬片的制作有利于樹突狀細胞動態(tài)蛋白標記研究，結合激光共聚焦掃描的激光顯微外科手術光子刀技術、籠鎖化合物技術，可深入到樹突狀細胞的呈遞機制和免疫應答和細胞間通訊、膜流動性的研究。

4 結論

對單一蛋白研究時，細胞滴片陽性細胞比例更高，蛋白免疫反應性更優(yōu)，利于標記目的蛋白，研究胞內(nèi)蛋白表達變化以及進行亞細胞定位。細胞爬片的制作方法簡便，可縮短試驗時間，易于維持細胞形態(tài)學特征和保持ROBO2蛋白特性，綜合顯色性更強，更有利于在體外研究骨髓源雞樹突狀細胞的ROBO2與新城疫病毒NDV的關系，為開展家禽抗病育種研究提供技術基礎和方法。激光共聚焦掃描作為一種分子細胞生物學分析儀器，與細胞免疫熒光技術相結合，應用于檢測細胞內(nèi)外源蛋白表達情況，有助于進一步提高細胞生物學實驗技術，利于深入研究樹突狀細胞等各種細胞的免疫功能、遷移作用和疫苗生產(chǎn)。