豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法及其引物

冷超糧/南陽理工學院 473000

1 研究背景

豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）是豬的一種急性、高度接觸性的傳染性病毒。它引起的豬瘟（Classical swine fever,CSF），臨床上主要表現為稽留高熱、皮膚和粘膜有大量出血點以及白細胞減少癥等。CSF被世界動物衛生組織（OIE）和我國農業部列為一類動物傳染病。各年齡段、各類型豬均易感。因其流行廣，發病率及死亡率高，給養豬業造成了巨大的經濟損失。近年來，多種CSFV新亞型變異毒株不斷出現，給該病的防控帶來了更為嚴峻的挑戰。因此，建立快速、靈敏、成本低又操作方便的檢測方法十分必要。本實驗將建立新型豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法。

2 實驗方法和步驟

2.1 引物的設計與合成 根據實驗室保存的CSFV毒株HNC1NS5B的基因序列，比對GenBank中CSFV各亞型代表株，Shimen（AF092448）、HCLV（AF091507）、Brescia（AF091661）、Paderborn（GQ902941）、Alfort（J04358）、Zj0801（FJ529205）和JSZL（KT119352）的5‘NTR序列，設計特異性引物，擴增目的片段大小為98bp，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；

上游引物QCSFV-F，序列為：CCCTCCAGCGACGGCCG；

下游引物QCSFV-R，序列為：ACTTAGACCACCCAGGGAG；

2.2 5‘NTR基因的克隆

2.2.1 待PK-15細胞長到單層約90%密度時，將培養基棄去并用PBS溶液洗滌2次，按照MOI: 0.5的量將CSFV HNC1病毒液加入T25培養瓶中，并補充無血清的DMEM培養基至5mL，將培養瓶放入37℃ 5% CO2培養箱中繼續培養4～5d，然后將培養瓶放入-80℃冰箱，反復凍融3次后將病毒液取出，以9000g離心5min，取上清-80℃保存備用。病毒RNA提取按照北京全式金生物技術有限公司EasyPure?Viral DNA/RNA Kit試劑盒說明書，取200μL已離心的病毒液上清進行總RNA提取。

2.2.2 按照北京全式金生物技術有限公司TransScript?-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進行反轉錄，總cDNA樣品保存至-80℃備用。按照北京全式金生物技術公司Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity (HiFI)試劑盒說明書進行PCR。PCR反應體系 為 20μL：10×HiFi Buffer I：2μL；2.5mM dNTPs：2μL；QCSFV-F：1μL（終濃度為 0.1μM）；QCSFV-R：1μ（ 終濃度為 0.1μM）L；HiFi DNA polymerase：0.5μL；cDNA：1μL；ddH2O: 12.5μL。反應條件為：95℃預變性5min，再以35個循環進行PCR擴增，擴增條件為95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后再72℃延伸10min。

PCR擴增完成后，取10μL產物用1%瓊脂糖凝膠電泳確定，鑒定為陽性的PCR產物用OMEGA Gel Extraction Kit試劑盒純化回收，然后克隆到pMD18-T載體，并轉化到DH5α平板，挑取陽性克隆，并進行測序鑒定。

2.3 標準曲線的建立 用OMEGA Plasmid Mini Kit I試劑盒提取重組質粒，然后用紫外分光光度計定量。將計算好拷貝數的標準DNA模板以10倍系列稀釋標準品，稀釋為終濃度在4.49×102～108copies/μL。定量RT-PCR反應體系為25μL：SYBR?Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QCSFV-F：1μL（終濃度為 0.1μM）；QCSFV-R：1μL（終濃度為 0.1μM）；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL。反應條件為：95℃預變性 10min，再以39個循環進行PCR擴增，擴增條件為95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后再先降到65℃持續5s，再升到95℃，再增加0.5℃結束，用以來繪制溶解曲線。儀器使用BIO-RAD CFX96TM Real Time System。

2.4 敏感性、特異性、重復性試驗

2.4.1 利用普通PCR和本實驗建立的熒光定量RT-PCR檢測方法分別檢測100～107TC ID50/m L不同模板量的病毒液，比較兩種方法檢測的敏感性。

2.4.2 利用本實驗建立的實時熒光定量RT-PCR檢測方法，分別檢測CSFV HNC1株、PRRSV、PRV、PEDV 和PCV2。進行特異性試驗。

2.4.3 取拷貝數為 105copies/μL、106copies/μL、107copies/μL的模板分別進行5次批內和批間重復試驗，以驗證 CSFV 熒光定量RT-PCR檢測方法的穩定性和重復性。

2.5 臨床樣品的檢測 臨床組織樣品（肺、脾、腎和淋巴結等），經勻漿后離心取上清或血清樣品，按照前述的RNA提取、反轉錄和PCR反應方法進行檢測。根據熒光定量PCR的結果和標準曲線計算樣品中病毒的含量。熒光定量PCR儀會自動顯示樣品的濃度。

3 結果判斷

3.1 5‘NTR基因的克隆 以 CSFV HNC1cDNA 為模板，利用自行設計的引物，PCR 擴增 5‘NTR基因片段，PCR產物經凝膠電泳檢測，與 DNA Marker 比較，結果顯示在98bp 有特異性 DNA 條帶，鑒定為陽性的PCR產物（見圖1）。

圖1 CSFV HNC1 5‘NTR基因的PCR擴增

3.2 標準曲線的建立 對樣品進行熒光定量RT-PCR檢測，使用儀器BIO-RAD CFX96TM Real Time System，繪制溶解曲線。在稀釋的線性濃度范圍內，模板量與對應的Ct值之間線性相關，相關系數為0.998。Ct值分別為32.78、28.84、24.83、21.05、17.28、14.03和 9.49，標準曲線的斜率為 -3.780，截距為42.686，直線方程為y=-3.780x+42.686（圖2）。

圖2 熒光定量RT-PCR檢測CSFV的擴增曲線（A）和標準曲線（B）

3.3 敏感性試驗 普通PCR最低能檢測到105TCID50病毒液（圖3），而該方法能檢測的最低模板量為101TCID50病毒液（圖4），比普通PCR檢測方法敏感10000倍。

圖3 普通RT-PCR檢測CSFV敏感性試驗結果

圖4 熒光定量RT-PCR檢測CSFV敏感性試驗結果

3.4 特異性試驗 利用本實驗建立的實時熒光定量RT-PCR檢測方法，檢測只有CSFV HNC1株檢測結果為陽性，其他對照樣品檢測結果均為陰性（圖5）

圖5 熒光定量RT-PCR檢測CSFV特異性試驗結果

3.5 重復性試驗 取拷貝數為 105copies/μL、106copies/μL、107copies/μL的模板分別進行5次批內和批間重復試驗，結果顯示批內變異系數均小于1%，批間變異系數均小于2%，說明該方法具有較好的重復性（見下表）。

C o p i e s/μ L n V i r a l s a m p l e s批內重復域值（C T值）批間重復域值（C T值）M e a n s S D C V(%)M e a n s S D C V(%)S a m p l e 1 1 0 5 5 2 2.5 1 0.2 2 0.9 7 2 2.9 4 0.3 7 1.6 6 S a m p l e 2 1 0 5 5 1 9.4 5 0.1 1 0.5 5 1 9.6 3 0.3 0 1.5 3 S a m p l e 3 1 0 5 5 1 5.2 2 0.1 4 0.9 4 1 5.1 1 0.2 2 1.4 7

4 小結

目前CSFV的病原檢測方法有間接免疫熒光（IFA）、抗原捕獲ELISA、普通的RT-PCR和熒光定量RT-PCR等。IFA需要較昂貴的顯微鏡和有經驗的實驗人員，且該法經驗性較強，耗時長，難度大?；诳乖东@ELISA法的試劑盒主要依賴進口，價格昂貴，而且敏感度較低，不利于普及。普通的RT-PCR方法具有操作簡便、快速和特異性強等特點，但在病毒含量較低時，會出現假陰性的結果。熒光定量RTPCR方法具有更高的敏感性、特異性和準確性等優點，受到多數學者的青睞。之前有學者成功建立了基于探針的熒光定量RT-PCR方法，但該法過于昂貴，且需要特殊的配套儀器。其他學者有建立的基于熒光染料的熒光定量RT-PCR方法，但使用的引物是基于病毒的變異較大E2蛋白設計，特異性差，不利于對多種不同亞型CSFV毒株的擴增。

由于以上存在的諸多問題，本實驗參考國內外流行的多種CSFV亞型毒株，基于高度保守的5‘NTR區，設計合成特異性引物，成功建立了豬瘟病毒SYBR?Green I熒光定量RT-PCR檢測方法。該法具有較好的特異性、敏感性和重復性，可用于所有亞型CSFV毒株的的快速檢測。