枯否細(xì)胞在肝移植脂肪供肝的缺血再灌注損傷中的作用研究進(jìn)展

蔡佳暉，王經(jīng)琳，任昊楨，施曉雷，

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 普外科，2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 普外科，江蘇 南京210008）

缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指缺血、缺氧的組織或器官在重新獲得血液及氧氣供應(yīng)后，損害不但沒有減輕，反而加重的病理生理過程。一般分為四個(gè)階段：器官離開供體到冷凍前的熱缺血期，冷藏器官以降低代謝率的冷缺血期，器官與肝移植患者進(jìn)行血管重建的復(fù)溫期，血流再通的再灌注期。肝臟IRI是肝移植的常見風(fēng)險(xiǎn)，影響手術(shù)的成功與否，也決定了移植后器官功能的恢復(fù)情況。

目前，肝移植患者的數(shù)量遠(yuǎn)超可用供肝的數(shù)量，諸如脂肪供肝這類邊緣供肝的應(yīng)用就愈發(fā)普遍[1]。然而，相較于正常供肝，脂肪供肝線粒體ATP生產(chǎn)能力下降[2]，這使其對(duì)IRI的耐受能力下降。同時(shí)，脂肪供肝內(nèi)的細(xì)胞色素P450酶代謝多余的脂肪酸并生成大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），導(dǎo)致枯否細(xì)胞（Kupffer cells，KCs）對(duì)凋亡信號(hào)更為敏感，促進(jìn)了脂肪供肝的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡需要ATP，當(dāng)ATP耗竭，凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃溃灾靖蔚奶攸c(diǎn)是中度凋亡和大量壞死（73%），這種細(xì)胞死亡類型的改變或許增強(qiáng)了脂肪供肝對(duì)促炎因子的敏感性[3]。而在IRI過程中，經(jīng)典活化的KCs將釋放大量炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18、血小板活化因子（platelet activating facter，PAF）、不同的前列腺素、干擾素（interferon gamma IFN）等，對(duì)組織產(chǎn)生有害作用。這表明在IRI過程中，KCs對(duì)脂肪供肝有著重要的影響。

移植前，脂肪肝中的KCs 體積增大，數(shù)量增多，且處于激活狀態(tài)[4]。當(dāng)發(fā)生IRI時(shí)，KCs進(jìn)一步激活，這與再灌注時(shí)大量?jī)?nèi)毒素（LPS）的涌入有關(guān)，也與肝內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，由于KCs本身的細(xì)胞特性，還與其極化狀態(tài)的改變有關(guān)，但具體機(jī)制尚未明確。

1 脂肪肝IRI的病理生理

隨著現(xiàn)代人飲食結(jié)構(gòu)的改變，高脂高熱量飲食愈發(fā)普遍，這就導(dǎo)致非酒精性脂肪肝病（NAFLD）人數(shù)日益增多，在亞洲地區(qū)NAFLD的總體患病率為29.62%[5]。當(dāng)肝臟發(fā)生脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴使細(xì)胞脹大，一方面導(dǎo)致肝血竇腔隙減小，血流不足，肝細(xì)胞缺氧壞死，另一方面保存器官時(shí)易發(fā)生脂肪固結(jié)，引起再灌注時(shí)肝細(xì)胞崩解。脂肪變性也改變了線粒體膜的脂質(zhì)組成和流動(dòng)性，使其易受到自由基的攻擊，同時(shí)，細(xì)胞器的主要抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽（GSH）也發(fā)生下降。于是在IRI時(shí)，大量氧自由基生成，脂肪肝內(nèi)脂質(zhì)過氧化，氧自由基直接損傷細(xì)胞組成，或產(chǎn)生炎性因子和黏附分子造成間接損害。KCs的激活是脂肪肝IRI加劇的另一原因，這一點(diǎn)將在下文著重介紹。

2 KCs的基本形態(tài)

KCs是一種肝固有巨噬細(xì)胞，來源于骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞[6]，占全身巨噬細(xì)胞總數(shù)的80%～90%，約占肝臟細(xì)胞總數(shù)的15%[7]。KCs體積較大，形態(tài)不規(guī)則，可伸出絲狀偽足依附于肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞表面或經(jīng)窗孔伸入Disse間隙內(nèi)，與肝細(xì)胞微絨毛交錯(cuò)，這樣的結(jié)構(gòu)方便其協(xié)調(diào)或影響其他細(xì)胞的功能。KCs含有多種溶酶體酶，其質(zhì)膜表面可表達(dá)多種受體，如Toll樣受體（toll like receptor，TLR）、內(nèi)毒素受體、清道夫受體、Fc受體、補(bǔ)體受體、半乳糖胺受體等。KCs的結(jié)構(gòu)及酶學(xué)特點(diǎn)均表明其具備吞噬、分泌、免疫調(diào)節(jié)與監(jiān)視的作用。在受到刺激后，KCs將釋放大量細(xì)胞因子、趨化因子、炎癥介質(zhì)、活性氧中間產(chǎn)物和一些其他的因子[8]。

3 KCs的功能

KCs在多種肝臟疾病中發(fā)揮重要作用。發(fā)生急性肝衰竭時(shí)，損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）釋放，激活固有免疫，KCs通過釋放炎癥因子和趨化因子產(chǎn)生炎癥環(huán)境；在NAFLD中，KCs被激活，TNF-α、IL等多種細(xì)胞因子，使NAFLD向非酒精性脂肪肝炎（NASH）進(jìn)展；KCs與自然殺傷（NK）細(xì)胞相互作用可能是肝纖維化過程中的一個(gè)調(diào)控因素[9]，這對(duì)預(yù)防肝硬化有積極意義。

KCs在肝移植的IRI中也有重要作用。在肝臟IRI的熱缺血期，由于肝臟處于相對(duì)缺氧狀態(tài)，無氧酵解增多易引起代謝性酸中毒，同時(shí)ATP的減少導(dǎo)致細(xì)胞膜離子交換紊亂，在這些因素的影響下，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升，形成鈣超載。增多的鈣離子，一方面使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，這一轉(zhuǎn)變將加速氧自由基的產(chǎn)生，另一方面也激活了KCs，釋放細(xì)胞因子損傷肝臟。此外，冷缺血期主要損害肝非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞，機(jī)制與熱缺血期類似，在這一階段，NF-κB受到應(yīng)激，活性增強(qiáng)，使細(xì)胞因子基因表達(dá)增多[10]。在再灌注期，大量LPS隨血流進(jìn)入肝臟，與KCs表面受體結(jié)合，釋放細(xì)胞因子，導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)[11]。顯然，在整個(gè)肝移植IRI過程中，KCs都扮演著重要角色，因此，明確KCs的作用機(jī)制將有助于提高肝移植術(shù)后供體肝的存活率與功能。

4 KCs加重脂肪供肝IRI進(jìn)程的機(jī)制

脂肪供肝一般來源于NAFLD患者，其肝臟內(nèi)的KCs處于激活狀態(tài)[4]，這是NAFLD發(fā)展為NASH的重要原因，也就是說相較于正常供肝，脂肪供肝本身的基礎(chǔ)條件較差。當(dāng)發(fā)生肝臟IRI，脂肪供肝內(nèi)的KCs進(jìn)一步激活，這可能與大量LPS的涌入、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及極化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變有關(guān)。

4.1 加重脂肪供肝IRI時(shí)KCs的激活與大量LPS的涌入有關(guān)

門靜脈血中含有許多微生物相關(guān)抗原，主要為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分LPS。正常情況下，外周靜脈血中的LPS含量極低，無法測(cè)得，但在門靜脈血中高達(dá)1.0 μg/L。在肝移植過程中，隨著再灌注的開始，門靜脈血流開放，KCs被進(jìn)入肝臟的LPS進(jìn)一步激活。KCs質(zhì)膜表面可表達(dá)多種受體，LPS一方面與LPS受體CD14結(jié)合，激活KCs釋放炎癥介質(zhì)，另一方面與TLR4結(jié)合，通過引起KCs內(nèi)鈣超載激活NF-κB[12]，大量釋放炎性因子、氧自由基及趨化因子。正常肝臟內(nèi)的KCs通過上調(diào)抗炎基因精氨酸酶1和IL-10來抑制LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)LPS耐受，但當(dāng)肝臟存在脂肪變性時(shí)，這種保護(hù)機(jī)制受到了損害[13]，所以在脂肪肝中，LPS涌入激活KCs后造成更重的炎癥損傷。

LPS激活KCs分泌多種炎性因子，包括TNF-α、INF、IL等。TNF-α是主要的炎性因子之一，低水平的TNF-α是肝細(xì)胞生長(zhǎng)分化與再生所必需的調(diào)節(jié)因子，而高水平的TNF-α主要誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡與壞死。正常狀態(tài)下TNF-α可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、炎癥、凋亡等一系列病理生理過程；而在脂肪肝IRI中，大量釋放的TNF-α則導(dǎo)致肝臟損傷。已有研究表明，TNF-α的水平與供肝的損傷程度呈正相關(guān)，高濃度TNF-α是LPS引起肝臟炎癥反應(yīng)以及肝細(xì)胞凋亡的主要原因[14]。IL在傳遞信息、激活調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起重要作用，其中IL-1β、IL-18等促炎因子主要來源于NLRP3炎癥小體。NLRP3被KCs激活后發(fā)生寡聚化并招募適配器蛋白，然后與caspase-1結(jié)合，形成炎癥小體，導(dǎo)致caspase-1的裂解和活化，促進(jìn)了IL-1β和IL-18的成熟和分泌[15]。INF是一種主要用于抗病毒的糖蛋白，同時(shí)也有免疫調(diào)節(jié)的作用，它與TNF-α以及IL-2、IL-12都能增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，引起更強(qiáng)的移植物免疫排斥反應(yīng)。所有這些細(xì)胞因子，除了介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（endothelial cell adhesion molecule，ECAM）表達(dá)的上調(diào)，同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生了PAF[16]。因此，大量白細(xì)胞和血小板聚集于肝血竇區(qū)，引發(fā)“無復(fù)流”現(xiàn)象，使肝臟缺血缺氧，間接對(duì)肝臟造成了損害。

趨化因子是一類可溶性細(xì)胞因子，它作為趨化劑引導(dǎo)細(xì)胞，特別是免疫細(xì)胞的遷移[17]。KCs經(jīng)LPS激活后產(chǎn)生的趨化因子CCL2（也稱為MCP1）是肝內(nèi)主要的促纖維化細(xì)胞，它可以聚集淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)肝組織，釋放蛋白水解酶，損傷內(nèi)皮細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)，大量細(xì)胞的聚集加劇了前文所述炎癥因子引起的肝血竇區(qū)“無復(fù)流”現(xiàn)象，使得肝內(nèi)血流灌注進(jìn)一步減少，加重肝組織損傷[18]。

4.2 加重脂肪供肝IRI時(shí)KCs的激活與氧化應(yīng)激有關(guān)

KCs的氧化應(yīng)激是早期損傷的表現(xiàn)，此時(shí)KCs產(chǎn)生和釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括超氧陰離子和過氧化氫，對(duì)肝臟造成急性損傷[19]。ROS一方面可以損傷呼吸鏈中的酶復(fù)合物，引起細(xì)胞凋亡，另一方面可以上調(diào)促炎因子，造成炎癥損傷。當(dāng)發(fā)生IRI時(shí)，由炎癥小體介導(dǎo)的無菌性炎癥反應(yīng)過程被啟動(dòng)，其中NLRP3炎性小體發(fā)揮主要作用[20]，而KCs產(chǎn)生的大量ROS可通過各種途徑激活NLRP3炎性小體，最終產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。在脂肪供肝中，會(huì)產(chǎn)生更多的ROS，加重了肝臟IRI[21]。Yang等[22]認(rèn)為，其中的機(jī)制可能與以下有關(guān)：（1）脂肪變性導(dǎo)致細(xì)胞體積增大，肝血竇減小，脂肪肝本就處在相對(duì)缺血缺氧的環(huán)境；（2）線粒體氧化不足，生成的ATP無法滿足缺血再灌注過程中的能量需求，就會(huì)產(chǎn)生更多的ROS；（3）脂肪肝內(nèi)KCs處于應(yīng)激狀態(tài)，非IRI狀態(tài)下也會(huì)生成炎癥因子。也有研究指出，脂肪供肝在IRI過程中線粒體損傷加重，線粒體氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化作用增加，除了ROS的增多，抗氧化防御機(jī)制也受到損害，因此受到更重?fù)p傷。

4.3 脂肪供肝IRI時(shí)KCs的激活與極化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變有關(guān)

KCs有兩種表型，M1型為經(jīng)典激活型，參與機(jī)體炎癥、防御反應(yīng)，此時(shí)主要釋放TNF-α等促炎因子；M2型為替代激活型，參與機(jī)體抗炎、修復(fù)作用，此時(shí)IL-10等抗炎因子顯著增多。當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變，KCs誘導(dǎo)分化為不同表型，發(fā)揮不同的功能，在適當(dāng)條件下兩種表型還可相互轉(zhuǎn)化[23]。正常狀態(tài)KCs為M2型，當(dāng)肝臟發(fā)生脂肪變性，分解出的一些促炎脂肪酸將募集單核細(xì)胞，并在脂肪組織內(nèi)將其轉(zhuǎn)化為M1型的KCs，在IRI過程中，TLR的激活以及ROS的產(chǎn)生，也會(huì)將KCs轉(zhuǎn)化為M1型。所以在肝移植過程中，脂肪供肝內(nèi)的KCs偏向M1型，其炎癥反應(yīng)也強(qiáng)于正常供肝[24]。

5 KCs減輕脂肪供肝IRI的機(jī)制

除了損傷作用，KCs對(duì)肝臟也存在著保護(hù)作用，前文提到替代激活的M2型KCs參與機(jī)體抗炎，并能修復(fù)組織，這主要通過產(chǎn)生一些生物活性物質(zhì)或上調(diào)表達(dá)一些酶類來實(shí)現(xiàn)。M2型KCs可以產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子IL-10，使T細(xì)胞失功能或無功能，或是表達(dá)凋亡相關(guān)因子配體（FasL）和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL），引發(fā)T細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)肝臟的免疫耐受[25]，這將減輕缺血再灌注損害后移植物的排斥反應(yīng)。另外，KCs可以生成可誘導(dǎo)一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），KCs激活iNOS后，促進(jìn)了NO的生成。NO是一種重要的血管擴(kuò)張劑，有研究證實(shí)NO因其抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管的功能，在肝的缺血再灌注損傷中發(fā)揮了保護(hù)作用[26]。同時(shí)，KCs會(huì)生成血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1），主要分布于KCs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與核周外模，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡以及抑制血小板聚集的作用[27]。Zeng 等[11]證明，HO-1增加后，大鼠血清中多種炎性因子的含量下降，從而減輕IRI。還有研究證明，外源性上調(diào)HO-1表達(dá)后，可以顯著保護(hù)肥胖Zucker大鼠的脂肪化肝臟，減少脂肪肝IRI[28]。HO-1還可以通過降解血紅素的產(chǎn)物CO來發(fā)揮保護(hù)作用。CO可以使KCs生成的TNF-α和IL-6減少，也可以下調(diào)因LPS激活KCs產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，這些都改善了肝臟IRI。

總的來說，LPS與KCs表面受體CD14及TLR4結(jié)合后激活NF-κB，一方面釋放大量炎癥因子，包括TNF-α、INF、IL-2、IL-12，在造成直接肝臟損傷的同時(shí)，導(dǎo)致ICAM與ECAM表達(dá)上調(diào)，造成間接肝臟損害；同時(shí)也生成更多的ROS，激活NLRP3炎癥小體生成IL-1β和IL-18，引起炎癥反應(yīng)，加重肝臟IRI。另一方面釋放IL-10及HO-1，HO-1還能生成CO，這些細(xì)胞因子都可以抑制炎癥因子，減輕炎癥反應(yīng)；而其釋放的iNOS可以生成血管擴(kuò)張劑NO，對(duì)肝臟IRI也有緩解作用（圖1）。

圖1 LPS激活KCs引起雙向作用：LPS與KCs表面受體CD14及TLR4結(jié)合后激活NF-κB，一方面釋放大量炎癥因子，包括TNF-α、INF、IL-2、IL-12，導(dǎo)致ICAM與ECAM表達(dá)上調(diào)；同時(shí)生成更多ROS，激活NLRP3炎癥小體生成IL-1β和IL-18。另一方面釋放抗炎因子，如IL-10、HO-1及iNOS，HO-1生成CO，iNOS生成NO。

6 小結(jié)

IRI是肝移植術(shù)后供體肝功能受損和失功能的重要原因，是多因子共同作用造成損傷的持續(xù)過程，KCs在其中起到重要作用。對(duì)于脂肪肝供肝，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性及肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)使其處在一個(gè)相對(duì)缺血缺氧且促炎的環(huán)境。所以當(dāng)IRI發(fā)生，LPS涌入后激活KCs釋放大量細(xì)胞因子，脂肪肝表現(xiàn)出更差的耐受力，而脂肪變性導(dǎo)致的氧化應(yīng)激加劇以及KCs極化狀態(tài)向促炎型改變也使脂肪肝在IRI中受到更重的損傷。除了損傷作用，KCs對(duì)肝臟也存在著保護(hù)作用，激活的M2型KCs參與機(jī)體抗炎，并能修復(fù)組織。當(dāng)前，脂肪供肝在肝移植術(shù)中應(yīng)用增多是無法逆轉(zhuǎn)的趨勢(shì)，研究如何減輕脂肪肝IRI具有重要意義，而KCs顯然是一個(gè)重要的靶點(diǎn)。