生物模板法合成三元硫化物及其抑菌活性

詹建波, 肖 果, 王 浩, 鄭 晗, 余振華, 雷 濤, 余 娟, 王家強

(1. 云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231； 2. 云南大學 a. 教育部自然資源藥物化學重點實驗室， b. 云南大學國家光電子能源材料國際聯合研究中心， c. 材料與能源學院， d. 化學科學與工程學院， 云南 昆明 650091)

無機抗菌材料具有廣譜高效的殺菌性能、環境友好等優點，使其成為抗菌材料中的研究熱點，如納米銀[1]、Ag/GO[2]、氧化石墨烯[3]等。而三元硫化物ABmCn[4]由于其在催化[5]、電化學[6]、生物醫學[7]等方面的應用而備受關注。目前低毒甚至無毒的金屬三元硫化物在抑菌領域的應用正在迅速興起，特別是其廣譜抑菌活性和低成本的獲取方式吸引了人們的目光，如Cu2SnS3[8]和Cu2ZnSnS4[9]對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌都有較好的抗菌活性；CdIn2S4對大腸桿菌具有良好的光催化滅菌活性[10]等。

合成金屬硫化物有多種方法如水熱/溶劑熱[11]、微波輻射[12]、模板法[13]等。在眾多方法中模板法是合成無機材料[14-16]的重要方法之一，通過加入不同的模板劑可以在材料合成過程中對其形貌、結構、排布等進行調控[17]，將納米材料的合成引導為難以獲得的形式。模板法中所用模板分為硬模板和軟模板，其中軟模板中生物模板法因其所具備的優良特點近年來被廣泛用于材料的合成[18]。目前，已經將很多軟模板(DNA[19]、谷胱甘肽[20]、木質素[21])用于制備新型納米材料。三元硫化物的生物模板合成相比于化學合成來說在保證所合成的材料準確性的前提下可以降低合成成本，增強相應性能等優點，如以水生植物的葉片為模板合成ZnIn2S4用以提高其光催化產氫性能[22]，以L-半胱氨酸為模板制備硫化鉍銀(AgBiS2)可以降低污染物的排放及控制相應成本[23]，利用碳纖維的網狀結構合成CuCo2S4納米片用以增強對葡萄糖氧化的電催化特性[24]等。

基于生物模板在材料制備中的優點，以及其特殊的抑菌性能，利用天然易得的植物或植物提取物(如橡膠乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物等)為模板，采用溶劑熱法制備了形貌各異的AgBiS2和Cu3BiS3材料，研究了其對枯草芽孢桿菌的抑制作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TTR III D/max-3B型X射線衍射儀；Quanta 200 FEG型掃描電子顯微鏡；JEM-2100型透射電鏡；Spectra max型酶標儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 三元硫化物(AgBiS2和Cu3BiS3)的合成[13,25]

取0.85 g AgNO3(或2.42 g Cu(NO3)2·3H2O)和2.42 g Bi(NO3)3·3H2O 溶于30 mL的乙二醇中，同時，稱取1.52 g的硫脲溶于20 mL乙二醇中，將該溶液加入到前者溶液中，持續攪拌30 min；分別將1.0 g的生物模板分散于10 mL的乙二醇溶劑中，將該模板溶液滴加至上述混合溶液中，持續攪拌3 h后，裝入聚四氟乙烯反應釜內襯中，在200 ℃下反應24 h，反應后自然冷卻至室溫，分別用無水乙醇和蒸餾水將所得樣品洗滌數次，90 ℃下干燥，得到黑色粉末材料為生物模板合成的AgBiS2或Cu3BiS3。

(2) 硫化鉍(Bi2S3)的合成

稱取2.42 g Bi(NO3)3·5H2O 或1.60 g BiCl3溶解在30 mL的乙二醇中；另稱取1.52 g的硫脲溶解于20 mL的乙二醇中，在不斷攪拌下，將兩種溶液混合后攪拌3 h后，裝入聚四氟乙烯反應釜內襯中，在180 ℃下反應24 h。反應后自然冷卻至室溫，分別用無水乙醇和蒸餾水將所得樣品洗滌數次，于90 ℃下干燥，得到黑色粉末材料為Bi2S3。

1.3 抑菌性能

(1) 菌種及培養

以枯草芽孢桿菌為培養對象，該菌體是一種需氧的有柱狀內芽孢的G菌，屬于芽孢桿菌屬，菌體為直桿狀，0.5～2.0 μm，無莢膜，周生鞭毛，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5 μm，該菌種在30 ℃恒溫箱中培養48 h后備用。

(2) 抑菌圈測定試驗

將牛肉膏蛋白胨培養液和培養皿放于高壓滅菌鍋(壓力為0.1～0.15 Mpa)中滅菌20 min，待培養基冷至適宜溫度時，在超凈工作臺上，將培養基倒入滅菌的培養皿中，保證每皿10～20 mL培養基，并放于培養箱中，37 ℃恒溫培養24 h。將500 μL配制好的懸菌液均勻涂布在培養基表面，然后加入沾有硫化物材料的圓紙片，將培養皿放入培養箱中，37 ℃恒溫培養24 h。采用平板打孔法，利用打孔器將濾紙打成圓紙片(約6.0 mm)，將其浸泡在無菌液中制成抑菌片，同時，將濾紙片浸入無菌生理鹽水，作為空白對照。取出抑菌片貼在含菌平板上，蓋好平面皿，于37 ℃恒溫培養箱，24 h后，測定產生的抑菌圈的直徑，并對抑菌圈較大的材料進行TEM檢測。

1.4 材料毒性

選取以苝醌提取物為模板制備的AgBiS2和Cu3BiS3為代表檢測硫化物材料對正常細胞的毒性。將正常細胞小鼠胚胎成纖維細胞(BABL-3T3)分別接種于96孔板中培養24 h，同時設置空白與對照組，然后將不同濃度的硫化物材料加到孔板中，分別培養24 h和48 h后，向每個孔中加入50 μL MTT溶液，置于培養箱中培養4 h。取出孔板，將其中的培養基吸走，加入150 μL二甲基亞砜，振搖15 min后，通過酶標儀在490 nm處測量每孔的吸光度。

2 結果與討論

2.1 XRD

(1) 不同生物模板AgBiS2的XRD

圖1為分別以橡膠乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物為模板制備的硫化鉍銀材料的XRD。可以看到，在10°～70°的衍射范圍內，5種不同的生物模板制備的AgBiS2樣品呈現出了相似的XRD譜圖。所有的衍射峰均可以歸屬于立方晶相[25]和六方晶[26]AgBiS2的衍射峰。

2/(°)

(2) 不同生物模板Cu3BiS3的XRD

圖2是分別以橡膠乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物為模板制備的硫化鉍銅材料的XRD。可以看到，在10°～70°的衍射范圍內，5種不同的生物模板制備的Cu3BiS3材料表現非常相似的衍射圖譜。所有的衍射峰均可以歸屬于斜方晶相Cu3BiS3[27]的衍射峰。

2/(°)

(3) 不同前驅體合成的Bi2S3的XRD

圖3為不同前驅體制備的Bi2S3材料的XRD。可以看到，分別以Bi(NO3)3和BiCl3為前驅體制備的兩種硫化鉍材料均呈現了相同的衍射峰。所有的衍射峰均可以歸屬于斜方晶相Bi2S3的衍射峰[28]。

2/(°)

2.2 SEM

(1) 不同生物模板AgBiS2的SEM

圖4為用掃描電鏡觀察下不同生物模板制備的AgBiS2樣品的形貌SEM。可以看出，不同生物模板合成的AgBiS2形貌不一，顆粒大小不均一。使用大豆粉為模板合成的AgBiS2(圖4a)，呈現顆粒狀結構；使用苝醌提取物為模板合成的AgBiS2(圖4b)，其結構呈現出雪花狀；使用三七粉為模板合成的AgBiS2(圖4c)，其結構為層狀堆積的多角星形狀；使用橡膠乳為模板合成的AgBiS2(圖4d)，主要為顆粒狀結構，同時伴有部分須狀形貌的產生；以菠菜提取物為模板合成的AgBiS2(圖4e)，其形貌為團聚的顆粒狀結構。

圖4(a)大豆粉；(b)苝醌提取物；(c)三七粉；(d)橡膠乳；(e)菠菜提取物為模板合成的AgBiS2的SEM圖

(2) 不同生物模板Cu3BiS3的SEM

圖5為用掃描電鏡觀察下不同生物模板制備的Cu3BiS3樣品的形貌SEM圖。以大豆模板合成材料的材料(圖5a)，其形貌主要為表面不光滑的不規則球狀結構；以三七粉為模板合成材料的形貌為由球狀、棒狀和少量塊狀組成結構(圖5b)；以橡膠乳為模板合成的Cu3BiS3的形貌(圖5c)也有多種結構(球狀、片狀和棒狀)的存在；以菠菜提取物模板制備的材料(圖5d)，其形貌主要呈現為片狀、表面長有毛刺的球狀和少量棒狀結構 。

圖5(a)大豆粉；(b)三七粉；(c)橡膠乳；(d)菠菜提取物為模板合成的Cu3BiS3的SEM圖

(3) 不同前驅體合成的Bi2S3的SEM

圖6是分別以硝酸鉍(a和b)和氯化鉍(c和d)為前驅體制備的硫化鉍的SEM。根據XRD的結果，這兩種前驅體均可以成功合成Bi2S3材料，但是其形貌卻不同，以硝酸鉍為前驅體合成的材料呈細長的棒結構，而以氯化鉍為前驅體合成的材料為由短粗的棒狀組成的球狀結構。

圖6不同前驅體(Bi(NO3)3 (a； b)和BiCl3 (c； d))合成的Bi2S3的SEM圖

2.3 抑菌活性

表1總結出了Bi2S3和Co3+/Bi2S3以及不同生物模板合成的AgBiS2和Cu3BiS3材料的抑菌實驗結果。其中Bi2S3和Co3+/Bi2S3均有抑菌圈的產生；對于AgBiS2材料，只有以苝醌提取物為模板的AgBiS2有抑菌圈產生；對于Cu3BiS3材料，5種生物模板合成的材料均有抑菌圈產生，其中苝醌提取物模板的Cu3BiS3產生的抑菌圈較大。

2.4 抑菌實驗的TEM檢測

圖7為不同材料的抑菌作用的TEM，用戊二醛固定作用后的細菌，以便于觀察。圖7a是抑菌前的枯草芽孢桿菌的TEM，可以看到該細菌具有完整的細胞壁。圖7b～7e分別為加入Bi2S3， Co3+/Bi2S3，苝醌提取物/Cu3BiS3和苝醌提取物/AgBiS2材料后抑制枯草芽孢桿菌生長的TEM。

表1 材料的抑菌效果

圖7不同材料的抑菌作用的TEM圖:(a)完整的枯草芽孢桿菌； (b)Bi2S3;(c)Co3+/Bi2S3；(d)苝醌提取物/Cu3BiS3； (e)苝醌提取物/AgBiS2

可以看出在加入棒狀Bi2S3和雪花狀苝醌提取物/AgBiS2抑菌材料后，細菌的芽孢壁開始收縮變形，表面開始出現凹凸不平的現象；而苝醌提取物/Cu3BiS3抑菌材料后，芽孢壁的一角已經破裂，同時伴有細胞質液體的流出，加入Co3+/Bi2S3抑菌材料后，細菌的芽孢壁完全破裂，已經無法觀察到細菌原有的結構形貌。該結果與抑菌圈的實驗結果相吻合，進一步表明，這些材料對枯草芽孢桿菌有較好的抑菌作用。

2.5 細胞毒性試驗

通過MTT法測試了硫化物材料對正常細胞BABL-3T3的細胞毒性。測試結果表明：即使在濃度高達100 μg mL-1的情況下，用硫化物材料培養的BABL-3T3細胞的細胞存活率仍高于79%(表2)，表明該材料對于正常細胞的毒性很低甚至沒有。

表2 細胞存活率

分別以橡膠乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物作為模板劑，采用溶劑熱合成法，制備了具有不同形貌的三元硫化物(AgBiS2和Cu3BiS3)。通過平板抑菌實驗和TEM表征檢測了不同形貌材料對枯草芽孢桿菌的抑制作用，并利用MTT法測試了三元硫化物對正常細胞的毒性。實驗結果表明：具有特殊形貌的Bi2S3(棒狀)、苝醌提取物/AgBiS2(雪花狀)、苝醌提取物/Cu3BiS3(棒狀)等對該細菌表現出較好的抑菌作用，該材料對正常細胞BABL-3T3的影響很小甚至沒有，這種特殊形貌材料的抑菌作用體現在抑菌過程的初始階段，即利用其尖銳的結構刺破芽孢表面的細胞壁而進入細菌體內。同時，硫化物表面游離的金屬離子通過靜電作用進一步與芽孢內細胞膜表面的蛋白質基團結合，阻礙細菌進行正常的能量代謝，導致芽孢細菌死亡，最終起到抑菌作用。