Notch信號通路介導的自噬改變在多囊卵巢綜合征中的作用及機制研究*

任楠楠，周 珊，劉紅莉△

(1.西安市人民醫院檢驗科 710004;2.西北婦女兒童醫院生殖婦科，西安 710039)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種女性常見的生殖內分泌疾病，能夠引起卵巢內顆粒細胞和卵泡細胞發育障礙，導致不孕和不良妊娠的結局[1-2]。研究表明，PCOS影響著5%～10%的育齡女性。PCOS主要臨床表現為肥胖、血脂異常及胰島素抵抗(IR)等。目前針對PCOS病理機制的研究較多，主要認為與基因的改變相關，例如一些合成激素分泌相關的基因、炎性因子、脂代謝相關基因及自噬相關基因等[3]。卵巢中的細胞反應可能是PCOS的最初病理機制，進而引起下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamus-pituitary-ovary axis，HPO)紊亂，激素水平出現異常導致臨床癥狀的產生。自噬是細胞發生的不同于凋亡的程序性死亡，過度的自噬對細胞來說無疑是一種損傷[4]。目前研究發現，卵巢中的顆粒細胞若發生過度自噬，則可能導致PCOS的發生。Beclin1蛋白分子是自噬發生的關鍵分子，是自噬泡形成的重要組成部分。Beclin1分子表達的水平能夠間接反映細胞自噬的狀態。調控自噬發生的信號通路較多，mTOR是最經典的一條通路，mTOR對自噬的發生能夠起到負面的調控作用[5]。然而對于mTOR上游調控的機制仍未闡明，深入研究PCOS過程中卵巢細胞Notch信號通路的改變，觀察Notch信號通路與mTOR相關分子的關系，闡明Notch信號通路對自噬表達水平的影響，將會為PCOS的防治提供理論依據和分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠(購自空軍軍醫大學動物實驗中心)；來曲唑(江蘇恒瑞醫藥)；HE染色試劑(武漢谷歌生物公司)；戊巴比妥鈉(北京化工廠)；Jagged1(美國Sigma公司)；噻唑藍(MTT)、RMPI-1640培養基(美國Sigma公司)；Actin、Beclin 1、mTOR、p70s6k、LC3、Hes1和Notch 1抗體(英國Abcam公司)；二甲亞砜(DMSO，美國Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠POCS模型的建立

運用MALIQUEO等[6]的方法，用來曲唑200 μg/d灌胃的方式建立PCOS大鼠模型。將體質量約為200 g的SPF級雌性SD大鼠40只，分為對照組、來曲唑干預組(200 μg/d)、Jagged1處理組、來曲唑+Jagged1處理組。SD大鼠每天保持光照12 h，環境溫度控制在20～24 ℃，濕度范圍是60%±5%，自由進食和飲水。

1.2.2血清樣本及卵巢組織的采集

實驗各組SD大鼠末次灌胃給藥后禁食過夜，次日稱量各組SD大鼠體質量，用2%戊巴比妥鈉麻醉后，剝離胸腔，暴露心臟，從心房抽取靜脈血，室溫放置30 min，2 500 r/min離心15 min，取上清液分裝凍存在-80 ℃冰箱中備用。抽取靜脈血后，在SD大鼠腰椎背側用75%乙醇消毒，雙側分別做一1 cm左右的切口，取出SD大鼠的雙側卵巢。一側用4%多聚甲醛固定，另一側放于離心管中存入-80 ℃冰箱。

1.2.3激素水平的測定

通過化學發光法對各組SD大鼠血清中的雌二醇(E2)、促卵泡生長激素(FSH)、促黃體生成素(LH)進行檢測。具體方法按照試劑盒說明書進行，每組各設兩個復孔，保證結果相對偏差在±15%范圍內，變異系數小于15%。

1.2.4卵巢HE染色

將在10%甲醛溶液中浸泡24 h以上的卵巢組織，常規石蠟包埋進行組織切片，厚度為3～4 μm，行HE染色：(1)二甲苯脫蠟；(2)乙醇水化；(3)蘇木精染色；(4)1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗10～20 s；(5)伊紅染色；(6)脫水，透明，封片。

1.2.5Hela 細胞培養及MTT檢測

Hela細胞常規37℃、5%的CO2、飽和濕度孵箱培養。細胞分為4組：空白對照組、白頭翁皂苷B4處理組(20 mg/mL)、Jagged1處理組、Jagged1+白頭翁皂苷B4處理組(20 mg/mL)。細胞接種在96孔板中，待細胞完全貼壁處于良好狀態下每孔加入20 μL濃度是5 mg/mL的MTT溶液，繼續放入細胞培養箱孵育4 h，用移液器分別吸去各孔中的上清液，每孔加入150 μL DMSO，運用酶標儀檢測各孔的吸光度值，計算細胞活力。

1.2.6Western blot 檢測自噬相關蛋白和信號通路

將4組處理的Hela細分別運用蛋白提取試劑盒提取蛋白樣品，運用紫外分光光度計進行蛋白濃度定量，蛋白濃度配平后放入-80 ℃冰箱保存。進行凝膠電泳(恒流條件下實施電壓80 V，電泳時間為120 min)，電轉(恒壓條件下實施電流250 mA，電轉時間為90 min)。4 ℃一抗(β-actin、Beclin 1、LC3、Hes1、Notch 1)孵育16 h，二抗室溫孵育2 h，用ECL發光法顯色。各組以β-actin蛋白作為內參。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 PCOS大鼠模型的建立

與對照組相比，PCOS模型組SD大鼠體質量顯著升高(P<0.05)，見圖1A；PCOS組與對照組相比血清中E2、FSH水平顯著降低(P<0.05)，見圖1B；對照組卵巢呈現大量黃體形態結構，存在不同發育階段的卵泡：例如竇狀卵泡、排卵前卵泡。卵泡顆粒細胞層排列緊密，形態結構正常。PCOS模型組卵巢則顯現為病理性的改變，黃體結構較少，并且發現卵泡大量擴張，顆粒細胞層排列稀疏，沒有放射冠及卵母細胞存在，存在卵巢間質細胞增生，卵巢呈典型多囊樣變性病變，見圖1C。

A：PCOS建模過程中各組體質量的改變；B：各組血清中雌二醇及促卵泡生長素的改變；C：HE染色檢測各組形態學改變；*:P<0.05。

2.2 PCOS能夠誘導自噬的發生

Western blot檢測顯示PCOS模型組與對照組相比自噬相關蛋白LC3和Beclin1表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖2A。RT-PCR檢測顯示PCOS模型組與對照組相比自噬相關蛋白LC3和Beclin1表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖2B。

**:P<0.01。

2.3 PCOS能夠抑制Notch信號通路的活化

Western blot檢測發現PCOS模型組與對照組相比，Notch1、Hes1蛋白處于抑制狀態，見圖3。

**:P<0.01。

2.4 激活Notch信號通路能夠降低自噬的發生，進而抑制PCOS的病理發生

Jagged1干預能夠引起Notch信號通路激活，與來曲唑共同處理后發現，來曲唑處理組的自噬相關蛋白表達降低，自噬發生可能受到抑制，同時，Jagged1+白頭翁皂苷B4處理組，細胞活力與單純白頭翁皂苷B4處理組增加，見圖4。

A：對照組;b:來曲唑干預組;c:Jagged1干預組;d:來曲唑+Jagged1干預組;*:P<0.05;**:P<0.01。

3 討 論

PCOS是當今影響育齡女性不孕不育的主要疾病，并對機體的內分泌存在一定的影響。其發病機制尚未闡明，本研究首先檢測了PCOS模型建立的是否成功，運用目前對于PCOS模型檢測的幾個指標進行觀察：血清中E2、FSH表達水平及卵巢組織的形態學觀察[7]。發現PCOS模型組與對照組相比血清中E2、FSH水平顯著降低，形態學檢測也發現卵巢病理性的改變：黃體結構較少，并且發現卵泡大量擴張，顆粒細胞層排列稀疏，沒有放射冠及卵母細胞存在，存在卵巢間質細胞增生，卵巢呈典型多囊樣變性病變。諸多的結果表明本研究PCOS模型建立成功。自噬是細胞內的一種生理活動，在細胞各種應激過程中均會表達異常，有研究指出自噬與許多疾病的發生存在著緊密的聯系[8]。為了進一步揭示PCOS的發病機制，本研究檢測了PCOS卵巢組織中自噬水平的表達情況，Beclin1和LC3分別是自噬發生過程中的關鍵蛋白分子，兩種蛋白水平的改變可以代表細胞自噬的水平[9]。Western blot檢測提示PCOS模型組自噬相關蛋白LC3、Beclin1表達水平增高。研究表明，自噬屬于細胞的第二程序性死亡，參與細胞多項生理活動，且自噬的發生可能與PCOS關系密切[10-11]。本研究也發現PCOS模型組自噬水平上調，提示自噬的異常表現可能是導致PCOS的病理機制之一。調控自噬發生的信號通路較多，其中最為經典的為mTOR/p70s6k信號通路[12]。本研究為揭示PCOS模型中引起自噬水平升高的分子機制，運用Western blot檢測了mTOR/p70s6k信號通路的活化狀態，提示PCOS抑制了mTOR/p70s6k信號通路。PCOS很可能是通過mTOR/p70s6k信號通路調節自噬發生的。Notch信號通路與mTOR關系緊密，且參與細胞的免疫、應激、生長、分化及細胞增殖等各項生命活動[13-15]。本研究檢測了Notch信號通路相關分子的改變情況，結果提示PCOS能夠抑制Notch信號通路上的相關分子Notch1，Hes1，Notch信號通路可能參與了PCOS的病理發生過程。為了進一步驗證Notch信號通路在PCOS發病過程中的分子機制和作用，運用Notch信號通路的一種激活劑Jagged1在PCOS建模過程中進行干預，觀察Notch信號通路激活后自噬水平和PCOS病理進程的改變。結果發現經過Notch激動劑的干預，PCOS模型建立的過程中病理進程有所緩解，血清中E2、FSH水平與模型組相比有所升高，提示Notch信號通路活化能夠改善PCOS的發生。用Western blot檢測了Notch信號通路活化后，mTOR/p70s6k信號通路的改變，結果提示，mTOR/p70s6k信號通路與模型組相比處于活化狀態。本研究檢測了自噬相關蛋白Beclin1和LC3的水平，經過Notch信號通路激活劑干預后，卵巢組織中自噬相關蛋白表達受到抑制。驗證了Notch信號通路對自噬具有一定的調控作用，且激活Notch信號通路改善PCOS的發生很可能是通過調控自噬來完成的。

本研究證實了自噬的發生在PCOS發生中的重要作用，進一步揭示了mTOR/p70s6k信號通路及Notch信號通路的改變，闡明了Notch信號通路對自噬的調控作用在PCOS發生過程中的重要意義。為臨床上PCOS的治療和預防提供了重要的分子靶點和理論依據。