中藥質(zhì)量評價(jià)關(guān)鍵問題與分析方法探討

王 帥，包永睿，李天嬌，楊欣欣，孟憲生*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116600)

中藥質(zhì)量是保障藥品安全有效、穩(wěn)定可控的基礎(chǔ)。同樣，中藥的質(zhì)量控制問題一直是制約我國中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問題。我國現(xiàn)行的中藥質(zhì)量評價(jià)模式與控制體系主要以發(fā)達(dá)國家對化學(xué)藥品的質(zhì)量控制為借鑒。然而，化學(xué)藥品成分單一、療效與機(jī)制明確，對于含有成百上千種化學(xué)成分的單味中藥乃至中藥復(fù)方而言，該體系并不完全適用。在科技手段進(jìn)步與發(fā)展的同時(shí)，人們對中藥質(zhì)量檢測方法與手段的探索與革新也從未停止。以具有法定標(biāo)準(zhǔn)效力的《中國藥典》為例，從1953年至今已頒布11版，在薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等常規(guī)檢測方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步擴(kuò)大了對新技術(shù)、新方法的應(yīng)用，將液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、分子生物學(xué)檢測技術(shù)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法等用于中藥的質(zhì)量控制，以提高檢測的靈敏度、專屬性和穩(wěn)定性，加強(qiáng)對用藥安全性和有效性的保障。

質(zhì)控方法是手段，保障療效是目的，“找到有效成分”、“合理控制有效成分含量”是中藥質(zhì)量檢測的關(guān)鍵所在，是保障療效的核心問題。為此，多年來廣大科研工作者做出了許多有益的探索，本文主要圍繞“發(fā)現(xiàn)”與“控制”有效成分的中藥質(zhì)量評價(jià)方法進(jìn)行探討，為豐富和完善中藥質(zhì)量控制方法，以及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的提升提供借鑒。

1 中藥“譜-效”關(guān)系研究

中藥譜效學(xué)的概念最早于2002年由李戎等提出[1]。它是指在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，將中藥指紋圖譜和藥效學(xué)通過化學(xué)計(jì)量學(xué)模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)，建立以化學(xué)分析與生物活性評價(jià)相結(jié)合的綜合評價(jià)體系[2]。筆者統(tǒng)計(jì)了2002年1月～2020年9月CNKI中文期刊收錄的中藥“譜-效”關(guān)系研究相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)文章數(shù)量呈逐年上升趨勢(見圖1)。經(jīng)過近20年的實(shí)踐與發(fā)展，中藥譜效學(xué)在質(zhì)量控制方面，為中藥活性成分的篩選與質(zhì)控指標(biāo)的選擇提供了重要的參考依據(jù)。

中藥“譜-效”關(guān)系研究的目標(biāo)是尋找中藥化學(xué)成分差異與藥效差異的對應(yīng)關(guān)系。指紋圖譜的建立、藥效學(xué)評價(jià)及將二者相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)分析技術(shù)是中藥“譜-效”關(guān)系研究的3大基本要素(圖2)。

圖2 中藥譜效關(guān)系研究要素與方法Fig.2 Research elements and methods of the relationship between spectrum and effect of traditional Chinese medicine

1.1 指紋圖譜的建立

通常采用高效液相色譜法、氣相色譜法、液相/氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法或紅外光譜法等檢測手段，針對不同產(chǎn)地、不同采收期、不同提取工藝或不同批次(即含有變量)的中藥/中藥復(fù)方，建立相應(yīng)指紋圖譜。其中高效液相色譜法(HPLC)是應(yīng)用最為廣泛的方法，質(zhì)譜方法常用于進(jìn)一步的化學(xué)成分表征。王瑩等[3]利用HPLC建立了15批芍藥甘草湯煎液的指紋圖譜，探討了芍藥甘草湯物質(zhì)組分對癲癇小鼠腦組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和三磷酸腺苷(ATP)酶水平影響的譜效關(guān)系，篩選出芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷等對MDA、SOD和ATP的酶活性影響有貢獻(xiàn)的成分。呂婧等[4]采用液相色譜-串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-Q-TOF MS/MS)建立了20批不同產(chǎn)地西洋參皂苷類成分的指紋圖譜，研究了西洋參皂苷類成分指紋圖譜與其增強(qiáng)免疫力作用的譜效關(guān)系，結(jié)果在標(biāo)定的22個(gè)共有峰中，篩選出6個(gè)與增強(qiáng)免疫活性具有顯著相關(guān)性的成分。許平翠等[5]采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)建立了15批不同產(chǎn)地白術(shù)飲片揮發(fā)油的指紋圖譜，并研究了該指紋圖譜與抗氧化活性的相關(guān)性，分別篩選出揮發(fā)油清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基活性最強(qiáng)的5個(gè)成分和還原Fe3+能力最強(qiáng)的5個(gè)成分，證明了蒼術(shù)酮是白術(shù)主要的抗氧化活性物質(zhì)。此外，基于血清藥物化學(xué)理論，即“多數(shù)成分在發(fā)揮療效時(shí)首先要被人體吸收”理論，竇志華課題組[6]于2007年提出了中藥血清譜效學(xué)概念，將中藥“譜-效”關(guān)系研究提升到生物表達(dá)層面，豐富了譜效理論的研究內(nèi)容[7]。竇志華等[8]通過將SD大鼠灌胃制備茵陳蒿湯及其各單味藥、各缺味方含藥血清，建立了不同方劑配伍組含藥血清的HPLC指紋圖譜，同時(shí)評價(jià)了不同方劑配伍含藥血清的保肝作用藥效，并尋找指紋圖譜中與藥效相關(guān)的色譜峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于大黃的蒽醌類成分及體內(nèi)代謝產(chǎn)物、來源于梔子的環(huán)烯醚萜類成分及體內(nèi)代謝產(chǎn)物和西紅花酸類成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物是茵陳蒿湯保肝作用的藥效物質(zhì)，其中1個(gè)蒽醌類成分體內(nèi)代謝產(chǎn)物活性較強(qiáng)。

1.2 藥效學(xué)評價(jià)

在藥效學(xué)評價(jià)方面，對于整體動(dòng)物、組織器官、細(xì)胞水平、分子水平4個(gè)研究層次均有文獻(xiàn)報(bào)道。涉及抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗?jié)儭⒖寡趸?、保肝、免疫調(diào)節(jié)、促胃腸動(dòng)力、補(bǔ)腎等諸多藥理活性。張希等[9]基于經(jīng)典名方五子衍宗丸的補(bǔ)腎益精作用，考察了不同批次五子衍宗丸提取物對雷公藤多苷致腎精虧虛證大鼠卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)、一氧化氮(NO)水平的影響，經(jīng)譜效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)五子衍宗丸補(bǔ)腎澀精藥效成分主要集中在水飽和正丁醇部位，對藥效貢獻(xiàn)最大的為綠原酸，其次為槲皮素。何前松等[10]研究了疏毛吳茱萸提取物指紋圖譜特征峰所代表的化學(xué)成分與緩解家兔離體腸平滑肌痙攣的相關(guān)性，篩選出主要活性物質(zhì)可能為吳茱萸堿、吳茱萸次堿、綠原酸及其異構(gòu)體、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、去氫吳茱萸堿、14-甲?；鋮擒镙谴螇A和檸檬苦素。樊佳新等[11]采用HPLC法建立了9種不同產(chǎn)地荊芥藥材乙醇提取物的指紋圖譜，并基于微流控芯片技術(shù)評價(jià)了不同產(chǎn)地荊芥藥材乙醇提取物誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡的抗腫瘤藥效，尋找二者之間的相關(guān)性，結(jié)果證明荊芥中發(fā)揮抗肺腫瘤作用的主要化學(xué)成分為香葉木素、木犀草苷、木犀草素、橙皮苷、芹菜素等。馬寧寧等[12]利用UPLC-Q-TOF MS建立了延胡索不同提取物的指紋圖譜，以核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)熒光素酶為標(biāo)志物對人體支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行抗炎活性實(shí)驗(yàn)，證明了黃連堿、小檗堿、巴馬汀、二氫血根堿和去氫紫堇堿是延胡索發(fā)揮抗炎作用的主要有效成分，并進(jìn)一步結(jié)合分子對接技術(shù)推測延胡索通過作用于蛋白激酶C(PKC)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(ERK2)、抑制蛋白激酶β(IKKβ)、Janus激酶1(JAK1)、磷脂酰肌醇-3-激酶α(PI3K-α)、磷脂酰肌醇-3-激酶γ(PI3K-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)影響炎癥信號的傳遞。

1.3 數(shù)據(jù)分析技術(shù)

數(shù)據(jù)分析技術(shù)是建立譜效關(guān)系的重要組成要素。目前文獻(xiàn)報(bào)道的方法有相關(guān)分析(包括雙變量相關(guān)分析、多元相關(guān)分析、典型相關(guān)分析等)、回歸分析(包括多元線性回歸、偏最小二乘回歸等)、灰色關(guān)聯(lián)度分析、主成分分析、聚類分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。呂邵娃等[13]根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，將上述?shù)據(jù)分析技術(shù)歸為預(yù)測各成分與藥效間關(guān)聯(lián)度、闡明各成分對藥效貢獻(xiàn)率和簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)尋找主要活性成分3類。不同的數(shù)據(jù)處理方法，對中藥有效成分的篩選結(jié)果往往存在一定差異，應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法以及適用范圍選擇適宜的分析方法。

主成分分析、典型相關(guān)分析屬于簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的方法，是初步判斷化學(xué)成分對藥效貢獻(xiàn)大小的方法，在譜效關(guān)系研究中常與其他方法聯(lián)合使用。黃艷菲等[14]開展了基于譜效關(guān)系的藏藥材全緣葉綠絨蒿全草(非花入藥部位)抗氧化質(zhì)量標(biāo)志物研究，首先采用主成分分析法對總抗氧化能力、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和抑制超氧陰離子自由基能力4項(xiàng)具有相關(guān)性的活性評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行降維處理，篩選出能最大程度反映抗氧化活性的指標(biāo)—DPPH自由基清除能力，并以其為代表進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析最終從29個(gè)共有峰中確認(rèn)槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-[2′′-O-乙酰基-β-D-半乳糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]為全緣葉綠絨蒿全草的質(zhì)量標(biāo)志物。張華鋒等[15]開展了基于聚類分析和典型相關(guān)分析的北柴胡保肝作用譜效關(guān)系研究，建立10批次柴胡皂苷的HPLC指紋圖譜后，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析將藥材按總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分為4類，進(jìn)而采用變量聚類分析法尋找指紋圖譜共有峰中各元素間的親疏關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷a和柴胡皂苷d聚為一類；將HPLC指紋圖譜共有峰和樣本間的藥效結(jié)果均數(shù)作為共同變量進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)藥效指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)與柴胡皂苷a、柴胡皂苷d具有較高的相關(guān)性，進(jìn)一步的典型相關(guān)分析也證明柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為北柴胡保肝作用的部分藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

灰色關(guān)聯(lián)度分析法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、雙變量相關(guān)分析法是預(yù)測各成分與藥效間關(guān)聯(lián)度的分析方法。其中灰色關(guān)聯(lián)度分析法的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較多，適用于樣本信息量單一、影響因素較復(fù)雜的圖譜。黃瀟等[16]運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析法，開展了梔子提取物抗炎作用譜效關(guān)系研究，在對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理后，以足腫脹度作為藥效評價(jià)指標(biāo)，根據(jù)各色譜峰與藥效間的關(guān)聯(lián)系數(shù)，篩選出對抗炎作用藥效貢獻(xiàn)排名前5的色譜峰，并鑒定出梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷2種成分。再分別以一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)4種炎癥因子為指標(biāo)，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)處理，進(jìn)一步證明了這5種成分的抗炎作用。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對于成分與藥效之間存在的非線性關(guān)系具備較好的預(yù)測能力，馬雯芳等[17]開展了基于BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析滇桂艾納香止血作用的譜效關(guān)系研究，首先采用灰色關(guān)聯(lián)度法得到20批不同產(chǎn)地滇桂艾納香藥材指紋圖譜中13個(gè)共有峰與凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)3個(gè)止血藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)系數(shù)，找到與止血作用密切相關(guān)的色譜峰。再通過BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)MATLAB軟件建立譜效關(guān)系模型，運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測綜合藥效值，其相對誤差的絕對值均小于或等于13.6%，大部分?jǐn)?shù)值的相對誤差小于7.0%。在質(zhì)量控制過程中，可通過輸入指紋圖譜信息對其止血作用進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。

偏最小二乘回歸分析法和多元線性回歸法能夠闡明各化學(xué)成分對藥效的貢獻(xiàn)率。其中偏最小二乘回歸分析法是一種融合了多因變量對多自變量的回歸建模以及主成分分析在內(nèi)的多元數(shù)據(jù)分析方法[13]，可用于樣本數(shù)小于變量個(gè)數(shù)的數(shù)據(jù)分析，是目前中藥譜效關(guān)系研究中廣泛應(yīng)用并廣為認(rèn)可的方法。卞振華等[18]基于偏最小二乘回歸法開展了五味子抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)活性部位譜效關(guān)系研究，以特征指紋圖譜中代表化學(xué)成分各峰的峰面積為自變量X，五味子抗MRSA活性部位的抑菌系數(shù)為因變量Y，進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，通過回歸系數(shù)得到各特征峰的貢獻(xiàn)大小，篩選出檸檬酸、蘋果酸異構(gòu)體為五味子抗MRSA的活性物質(zhì)。為了滿足不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮万?yàn)證活性成分篩選的準(zhǔn)確性，多種化學(xué)模式識(shí)別方法的綜合運(yùn)用趨勢明顯。王帥等[19]采用灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)合偏最小二乘回歸法，建立了朝鮮天南星、東北天南星與其抗肝腫瘤之間譜效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)通過譜效學(xué)篩選出的活性成分相似，并探討了朝鮮天南星作為地方習(xí)用品的合理性。徐碩等[20]分別采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法和雙變量相關(guān)性分析法，建立了羅布麻葉指紋圖譜與其體外抗氧化活性的譜效關(guān)系，兩種方法所得結(jié)果基本一致，并篩選出綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素和山柰酚為羅布麻葉抗氧化作用的活性物質(zhì)。

1.4 “譜-效”色卡可視化質(zhì)量評價(jià)技術(shù)

雖然近年來中藥“譜-效”關(guān)系研究理論發(fā)展迅速，但在中藥質(zhì)量評價(jià)的實(shí)際推廣應(yīng)用方面仍存在一些問題。如多數(shù)中藥“譜-效”關(guān)系研究在藥效學(xué)評價(jià)時(shí)，僅針對某一特定藥效展開研究，而中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特性以及方劑配伍的影響，決定了其藥理活性、功能主治的非單一性，使得“譜-效”關(guān)系研究篩選出的有效成分往往僅具有參考價(jià)值，而不能成為法定質(zhì)量控制指標(biāo)，從而限制了其實(shí)際應(yīng)用。同時(shí)，科研應(yīng)以服務(wù)社會(huì)為目的，尤其是中藥質(zhì)量評價(jià)體系的建立，既要考慮保障臨床療效安全、穩(wěn)定的“高標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)要求”，又要顧及藥品生產(chǎn)企業(yè)“低成本、低投入”的實(shí)際需求。為此，筆者課題組結(jié)合多年研究經(jīng)驗(yàn)，以典型中藥大品種氣滯胃痛顆粒復(fù)方質(zhì)量評價(jià)體系的建立為例，首次開發(fā)了“譜-效”色卡可視化質(zhì)量評價(jià)技術(shù)[21]，探索中藥“譜-效”關(guān)系研究在中藥質(zhì)量控制方面的實(shí)際應(yīng)用。

圖3 “譜-效”色卡軟件可視化界面Fig.3 Visual interface of spectrum effect color card software

氣滯胃痛顆粒復(fù)方由柴胡、延胡索(炙)、枳殼、香附(炙)、白芍、炙甘草6味藥材組成，成分涉及黃酮類、生物堿類、皂苷類、三萜類等不同性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)組，具有促胃腸動(dòng)力、抗炎鎮(zhèn)痛、抗?jié)兌嘀毓π?。筆者課題組采用HPLC法建立了不同藥材配伍組氣滯胃痛顆粒指紋圖譜，分別以大鼠原代小腸平滑肌細(xì)胞、RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞、GES-1人胃粘膜上皮細(xì)胞構(gòu)建3種體外藥效模型，獲得不同配伍組藥理活性參數(shù)，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法分別構(gòu)建三者的譜效關(guān)系[22-24]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)揮不同功效的活性成分之間既存在一定相似性，又有所區(qū)別。如發(fā)揮促胃腸動(dòng)力作用的活性成分有柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、蕓香柚皮苷等，主要來自枳殼藥材；發(fā)揮抗炎作用的活性成分有甘草苷、蕓香柚皮苷、柴胡皂苷A、異甘草素、沒食子酸、甘草酸單銨鹽、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等，主要來自白芍、甘草等藥材；發(fā)揮抗胃潰瘍作用的活性成分有沒食子酸、甘草苷、甘草酸單銨鹽、芍藥苷、異甘草素、橙皮苷等，主要來自甘草等藥材[21]。在此基礎(chǔ)上，采用Visual Basic(VB)編程語言，設(shè)計(jì)開發(fā)了“譜-效”色卡軟件，采用體外藥效模型獲得的成分-藥效關(guān)系數(shù)據(jù)進(jìn)行軟件程序校正與閾值設(shè)置，將企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)出的不同批次氣滯胃痛顆粒指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)該批次產(chǎn)品促胃腸動(dòng)力、抗炎鎮(zhèn)痛、抗?jié)冏饔玫膯我凰幚砘钚院途C合活性預(yù)測。經(jīng)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，“色卡”軟件輸出結(jié)果與其藥效結(jié)果趨勢一致。該研究實(shí)現(xiàn)了簡單導(dǎo)入指紋圖譜即可預(yù)測藥效的中藥質(zhì)量可視化(圖3)，對于企業(yè)實(shí)現(xiàn)“高標(biāo)準(zhǔn)、低投入”的中藥質(zhì)量控制需求具有更為現(xiàn)實(shí)的意義。另外，此方法建立的中藥“譜-效”色卡綜合考慮了各成分間相互作用的藥效結(jié)果，經(jīng)體內(nèi)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，可逆向推斷藥效物質(zhì)基礎(chǔ)篩選的正確性與合理性，從而避免了譜-效關(guān)系研究產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。

2 全時(shí)段等基線多波長覆蓋融合指紋圖譜

中藥的質(zhì)量控制正在由單一指標(biāo)向多指標(biāo)含量測定、定性與定量相結(jié)合的趨勢發(fā)展。中藥指紋圖譜憑借其整體性的特點(diǎn)，結(jié)合多指標(biāo)含量測定，能夠滿足上述質(zhì)量控制要求。然而，中藥復(fù)雜物質(zhì)體系中存在不同的化合物類別，其最大吸收波長存在差異，單一波長圖譜有時(shí)并不能全面反映化合物整體信息。為此，筆者課題組通過對紅花、丹參、川芎、甘草、余甘子、蛇床子、木蝴蝶等中藥材，及氣滯胃痛顆粒、大川芎片、復(fù)方木雞顆粒等中藥復(fù)方的多年實(shí)踐[25-27]，豐富、發(fā)展了多波長融合指紋圖譜技術(shù)，提出“全時(shí)段等基線多波長覆蓋融合指紋圖譜技術(shù)”。該技術(shù)將現(xiàn)代分析檢測手段和信息處理手段結(jié)合，在保證基線穩(wěn)定不變的條件下，有效融合中藥多種指標(biāo)成分的譜圖信息，并對其進(jìn)行含量測定。所測成分均在最大紫外吸收波長下檢測，可以克服單一波長檢測時(shí)由于檢測限高帶來的定量不準(zhǔn)、信息量不足等缺點(diǎn)，從而可較完善地反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量。如針對不同批次氣滯胃痛顆粒，選擇230、254、283 nm 3個(gè)波長，Matlab軟件程序設(shè)計(jì)，建立了含有23個(gè)共有峰的多波長融合指紋圖譜，同時(shí)對其中來自不同藥材、發(fā)揮不同藥理作用的白芍藥苷、芍藥苷、甘草苷、柚皮苷、新橙皮苷、甘草酸鹽6種指標(biāo)性成分進(jìn)行了多指標(biāo)成分含量測定[28]。該方法穩(wěn)定、可靠，能夠?qū)鉁竿搭w粒復(fù)方進(jìn)行全面質(zhì)量控制。另外，將該技術(shù)與“一測多評”等評價(jià)方法相結(jié)合[29]，在全面、系統(tǒng)控制中藥質(zhì)量的同時(shí)還可以節(jié)約對照品，降低檢測成本，為合理的中藥質(zhì)量控制提供借鑒。

3 生物活性測定法

生物活性測定法是以藥物的生物效應(yīng)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，測定藥物有效性的一種方法，可達(dá)到控制藥品質(zhì)量的作用[30]。該方法將復(fù)雜的中藥活性成分作為“黑箱”，直接以藥效為切入點(diǎn)評價(jià)藥材質(zhì)量，逐漸受到中國、美國等國家的重視與認(rèn)可[31]。2010年版《中國藥典》發(fā)布了《中藥生物活性測定指導(dǎo)原則》，首次明確將中藥的生物活性評價(jià)方法作為中藥質(zhì)量控制的具體原則。該方法包括生物效價(jià)測定法和生物活性限值測定法，應(yīng)用時(shí)應(yīng)優(yōu)先選用生物效價(jià)測定法，對于不能建立生物效價(jià)測定的品種可考慮采用生物活性限值測定法?！端幍洹分胁捎媚傅味ǖ姆椒y定水蛭藥材抗凝血活性，用于水蛭藥材的質(zhì)量控制。謝曉華[32]以婦科千金片處方中具有抗菌作用的單面針和穿心蓮2味藥材為指標(biāo)，考察了它們的單煎混合液對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌4種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌作用，并根據(jù)建立的量效曲線測定了不同批號婦科千金片的生物效價(jià)。張莉華等[33]基于活血化瘀藥物多數(shù)具有的抗血小板聚集的作用機(jī)制，以中藥活性成分丹酚酸B作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立了家兔體外抗血小板聚集生物效價(jià)檢測方法，經(jīng)第三方實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證重現(xiàn)性良好。

生物活性測定法用于中藥質(zhì)量評價(jià)起步較晚，仍存在某些問題有待解決，如中藥所含化學(xué)成分復(fù)雜，尋找與待測樣品一致或活性相似的對照品具有一定難度，目前尚缺少生物測定用中藥標(biāo)準(zhǔn)品[34]；對于存在多種適應(yīng)癥的中藥，需對每種適應(yīng)癥分別建立相應(yīng)的生物活性檢測方法；目前的生物活性僅涉及抗菌、抗凝血、抗炎等相對簡單的藥理活性，對于大部分復(fù)雜的中醫(yī)功效尚缺少公認(rèn)的藥理評價(jià)模型等。但對于功能主治明確，有效成分模糊，檢測方法不完善的中藥，生物活性檢測方法能夠?yàn)槠滟|(zhì)量控制起到一定的補(bǔ)充作用。

4 展 望

中藥質(zhì)量問題是限制中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國家化發(fā)展的關(guān)鍵科學(xué)問題之一，完善中藥質(zhì)量評價(jià)方法一直受到國家及廣大科研工作者的重視與廣泛關(guān)注。保障藥材質(zhì)量是保障中藥療效的根本，而“尋找”與合理“控制”中藥有效成分又是中藥質(zhì)量檢測的關(guān)鍵。中藥“譜-效”關(guān)系研究方法是“發(fā)現(xiàn)”有效成分的有力手段，多波長融合指紋圖譜為合理“控制”有效成分提供了良好的檢測方法，而生物活性測定法則將中藥化學(xué)成分看作整體，從藥理活性角度入手建立評價(jià)方法，為豐富、發(fā)展中藥質(zhì)量評價(jià)體系提供了良好借鑒。在以上基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展中藥質(zhì)量評價(jià)及分析方法的研究工作尚有賴于廣大科研工作者不斷探索、創(chuàng)新和努力。