葛屬植物-根瘤菌共生體的研究進(jìn)展

胡書(shū)娟，詹慶才，劉 璐

（1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所， 湖南 長(zhǎng)沙 410125）

葛屬（Pueraria）是豆科蝶形花亞科下的一個(gè)屬，為蔓生性、多年生落葉藤本植物[1]。目前該屬約35種植物，包括野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]、粉葛[Pueraria thomsonii（Benth.）]、三裂葉野葛[Pueraria phaseoloides（Roxb.）Benth.]、黃毛萼葛（Pueraria calycina Franch.）、密花葛（Pueraria alopecuroides Craib）、小花 野葛（Pueraria stricta Kurz）等[2]。我國(guó)葛屬植物有12種，廣泛分布于除新疆、青海及西藏外的其他地區(qū)，具有適應(yīng)性廣、生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)、耐瘠薄等特性[3]。葛藤萌芽及生長(zhǎng)能力強(qiáng)，枝葉繁茂，根系發(fā)達(dá)，是優(yōu)良的水土保持植物和畜禽飼料[4]。其肥大塊根稱為葛根，富含優(yōu)質(zhì)淀粉和黃酮類物質(zhì)，具有很好的保健功能，被列入藥食同源的天然植物名單，是世界上重要的糧食替代作物之一[5]。

葛屬植物能夠與根瘤菌建立共生關(guān)系，通過(guò)生物固氮作用改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力[6]，適于作為先鋒植物應(yīng)用于重金屬污染土壤的修復(fù)和退化生態(tài)系統(tǒng)的植被恢復(fù)[7-8]。近年來(lái)，葛根在中藥材提取和食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用比例大幅度上升，其栽培面積隨之增加[2]。然而，目前對(duì)于葛屬植物共生根瘤菌的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。深入開(kāi)展葛屬植物-根瘤菌共生體的研究，挖掘優(yōu)良的根瘤菌種質(zhì)資源，對(duì)于充分發(fā)揮葛屬植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)功能具有重要意義。因此，筆者梳理了國(guó)內(nèi)外葛屬植物-根瘤菌共生體的研究進(jìn)展，并結(jié)合個(gè)人的研究工作展望了未來(lái)該領(lǐng)域的發(fā)展方向。

1 葛屬植物根瘤菌的資源調(diào)查

根瘤菌資源調(diào)查是開(kāi)展根瘤菌分類及遺傳多樣性、生物地理分布格局等研究的重要基礎(chǔ)，同時(shí)能夠發(fā)掘新的根瘤菌資源應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和牧業(yè)中。近30 a 來(lái)，陳文新院士及其團(tuán)隊(duì)等對(duì)我國(guó)30 多個(gè)省市不同生態(tài)環(huán)境下的豆科植物進(jìn)行全面地資源調(diào)查及系統(tǒng)地分類分析，獲得上萬(wàn)份豆科植物根瘤標(biāo)本，其中以大豆根瘤菌的資源調(diào)查及研究最為全面、系統(tǒng)[9-10]。雖然葛屬植物廣泛分布于我國(guó)各地，但對(duì)其根瘤菌資源的調(diào)查和研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。從已有的文獻(xiàn)看，以野葛根瘤菌的調(diào)查和研究較多，資源調(diào)查范圍涵蓋重慶、四川、貴州和廣西等地，包括了黃壤、紫色土和石灰 土等土壤類型（表1）。

表1 葛屬根瘤菌及其根瘤內(nèi)生菌的遺傳多樣性

根瘤一般長(zhǎng)在側(cè)根上，須根多的植株根瘤數(shù)量也較多[12,15,18-19]。根瘤直徑常在1～5 mm 之間，其大小與土壤的疏松度、濕度等密切相關(guān)；根瘤顏色多為淺褐色和淡黃色，根瘤形狀以球形最為常見(jiàn)，偶見(jiàn)珊瑚狀、姜狀和柱形[12]。葛藤須根系發(fā)達(dá)，其結(jié)瘤數(shù)量很多，且固氮效率較高，因此固氮總量非?？捎^[20]。粉葛、三裂葉野葛的根瘤菌資源調(diào)查較少，其結(jié)瘤特征與野葛基本一致[21-22]；密花葛、小花野葛等其他種的根瘤菌資源調(diào)查暫未見(jiàn)報(bào)道。

在根瘤菌資源研究中，主要采用2 種方式進(jìn)行采樣調(diào)查及研究。一種方法是廣泛采集某地理區(qū)域或生態(tài)區(qū)內(nèi)來(lái)自不同宿主植物的根瘤樣品，以了解該研究區(qū)域根瘤菌多樣性等[12,15-16]；另一種方法是采集來(lái)自不同地域的來(lái)源于同一植物的根瘤樣品，以用于根瘤菌生物地理學(xué)研究、根瘤菌與宿主之間的協(xié)同進(jìn)化 等[23-25]。由于葛屬植物根瘤菌資源調(diào)查難度遠(yuǎn)大于栽培豆科作物根瘤菌資源調(diào)查，現(xiàn)有的葛屬根瘤菌資源調(diào)查多局限于單一地理區(qū)域，缺乏不同地理區(qū)域或生境內(nèi)葛屬根瘤菌的比較研究。另外，在栽培種與野生種之間，與葛屬植物共生的根瘤菌是否存在差異，也有必要開(kāi)展更多的調(diào)查研究。

2 葛屬植物-根瘤菌共生體的遺傳多樣性

根瘤菌物種的準(zhǔn)確鑒定是進(jìn)行根瘤菌遺傳多樣性研究的基礎(chǔ)，根瘤菌分類方法從以宿主植物為中心的“互接種族”的傳統(tǒng)分類逐步發(fā)展到研究“系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系”的現(xiàn)代系統(tǒng)分類[9]。根瘤菌多屬于α-和β-變形菌綱，包括Rhizobium（根瘤菌屬）、Sinorhizobium（中華根瘤菌屬）、Mesorhizobium（中慢生根瘤菌屬）、Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）和Burkholderia（伯克氏菌屬）等[26]。根瘤菌的遺傳分群主要采用多相分類方法，廣泛使用的技術(shù)手段有基因組指紋圖譜分析、特定基因序列分析、DNA-DNA 雜交、G+C mol%及多位點(diǎn)序列分析（MLSA）等[27]。Konstantindis 等[28]提出以基因組平均核苷酸一致性（ANI）作為新的細(xì)菌種分類標(biāo)準(zhǔn)，Zhang 等[29]發(fā)現(xiàn)依據(jù)3 個(gè)核心基因（SMc00019，thrA，truA）計(jì)算的ANI 值在95%或96%水平上可以將根瘤菌鑒定到種。

國(guó)內(nèi)外對(duì)根瘤菌的分類與系統(tǒng)發(fā)育研究取得了較大的進(jìn)展，但葛屬植物根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育研究仍處于起步階段[27-30]。從已有的文獻(xiàn)來(lái)看，葛屬植物能與多個(gè)屬種的根瘤菌建立共生關(guān)系，如Rhizobium、Bradyrhizobium 和Mesorhizobium。野葛能與這3 個(gè)屬的多個(gè)種共生，而采集自四川的粉葛與Mesorhizobium 共生，采集自喀麥隆東部的三裂葉野葛與Bradyrhizobium 共生。由此可見(jiàn)，葛屬根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性（表1）。來(lái)源于不同區(qū)域、不同土壤條件的葛藤共生根瘤菌種群存在差異，表明葛藤根瘤菌可能存在顯著的生物地理學(xué)分布格局[11,13-14,17]。課題組前期對(duì)采集于桂西北喀斯特區(qū)（堿性石灰土）和湖南紅壤丘陵區(qū)（酸性土）的野葛根瘤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與野葛共生的根瘤菌均屬于慢生根瘤菌屬的多個(gè)種[15]。但是，分離自相近地點(diǎn)的野葛根瘤菌的親緣關(guān)系也較近，表明根瘤菌種群分布可能受地理距離的影響。目前，葛屬根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育研究多通過(guò)16S rDNA 基因序列來(lái)確定其屬的分類地位，無(wú)法準(zhǔn)確鑒定到種。在今后的研究中，有必要通過(guò)多基因序列分析、全基因組序列比較來(lái)確定葛屬根瘤菌種的分類地位。另外，共生基因的水平轉(zhuǎn)移是根瘤菌物種多樣性形成的主要原因[31]，需要加強(qiáng)葛屬根瘤菌的核心基因與共生基因（nodC、nifH 等）的研究，以揭示葛屬根瘤菌的進(jìn)化歷史，為建立葛屬植物-根瘤菌的高效共生體提供理論依據(jù)。

豆科植物根瘤內(nèi)存在許多非共生細(xì)菌，包括土壤桿菌、假單胞菌和芽孢桿菌等[10,32]。葛屬植物根瘤內(nèi)除了有能共生的根瘤菌外，還包括一些不具有結(jié)瘤能力的非共生根瘤菌和其他根瘤內(nèi)生菌[14,17]。非共生與共生根瘤菌之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，而且在植物根際共生基因橫向轉(zhuǎn)移過(guò)程中存在基因受體與供體的關(guān)系。Boonsnongcheep 等[14]從Pueraria candollei 根瘤中分離到一株非共生根瘤菌，經(jīng)鑒定為根瘤菌屬的一個(gè)新種，該菌株在回接試驗(yàn)中無(wú)法讓宿主結(jié)瘤，且根瘤DNA 擴(kuò)增不出nifH 基因和nodC 基因。另外，已發(fā)現(xiàn)的葛屬植物根瘤內(nèi)生菌包括Pseudomonas koreensis、Herbaspirillum huttiense 和Bacillus thuringiensis 等，其中部分內(nèi)生菌對(duì)宿主植物具有促生作用[12,17]。已有研究表明，在豆科植物根瘤內(nèi)，可能存在共生固氮基因從共生菌向內(nèi)生菌水平橫向轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[31]。通過(guò)對(duì)內(nèi)生菌-根瘤菌-葛屬植物相互作用的研究，有助于人們理解葛屬植物根瘤菌的起源和進(jìn)化，也為科學(xué)利用這些內(nèi)生菌的生態(tài)作用提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

3 葛屬植物-根瘤菌共生體的固氮效率

根瘤菌-豆科植物共生固氮作用受根瘤菌、宿主植物和土壤環(huán)境的共同影響。耕作方式（如免耕）通過(guò)影響土壤養(yǎng)分、物理性質(zhì)等間接影響豆科植物-根瘤菌共生體的固氮作用[33]。宿主植物的根際分泌物會(huì)影響根瘤菌的侵染和土壤養(yǎng)分的有效性等[34]；土壤環(huán)境主要包括土壤pH 值、水分、質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)元素等，影響根瘤形成、發(fā)育及固氮酶活性等[35-36]。土壤過(guò)酸（pH 值＜5.0）或過(guò)堿（pH 值＞8.5）均會(huì)嚴(yán)重抑制根瘤菌結(jié)瘤和固氮[37]；水分是限制根瘤菌侵染、結(jié)瘤和固氮的主要因子，在干旱脅迫條件下根瘤菌中參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的基因表達(dá)上調(diào)[38]；鹽脅迫使豆科植物根毛變形，從而降低根瘤菌的侵染率及固氮效率[39]；在氮素水平高的土壤中存在著“氮阻遏”現(xiàn)象，氮作為信號(hào)分子影響共生固氮基因的功能從而抑制共生固氮過(guò)程[40]。另外，鐵元素影響血紅蛋白、固氮酶等與共生固氮密切相關(guān)功能蛋白的合成，進(jìn)而影響共生固氮效率[41]。

共生固氮的測(cè)定方法主要有氮累積法、乙炔還原法、15N整合法、同位素稀釋法和15N自然豐度法5種[42]。乙炔還原法是最常用的方法，原理是利用固氮酶能將空氣中的N2還原為NH3，也能將乙炔還原為乙烯的特點(diǎn)，通過(guò)測(cè)定乙烯產(chǎn)生速率計(jì)算固氮效率。該法特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高[43]。15N 自然豐度法利用固氮與非固氮植物氮同位素特征的自然差異估算固氮速率[44]。該法優(yōu)點(diǎn)是不需收集根瘤，僅需收集葉片材料；缺點(diǎn)是固氮植物和非固氮參考植物間15N豐度的差異很小，測(cè)量誤差等導(dǎo)致結(jié)果具有高度的不確定性，較適用于農(nóng)業(yè)或草地生態(tài)系統(tǒng)。目前，關(guān)于葛屬植物-根瘤菌共生固氮作用的研究基本處于空白，課題組前期通過(guò)15N 自然豐度法粗略比較了喀斯特區(qū)域多種豆科植物（野葛、深紫木藍(lán)、香合歡、中南魚(yú)藤等）的共生固氮效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野葛-根瘤菌共生體的固氮效率高于深紫木藍(lán)、香合歡等多種植物，僅次于中南魚(yú)藤-根瘤菌共生體[20]?？紤]到野葛須根系特別發(fā)達(dá)，結(jié)瘤數(shù)量巨大，因此野葛-根瘤菌共生體的固氮總量極其可觀，其對(duì)于退化土壤的修復(fù)具有重要意義。今后，需要進(jìn)一步加強(qiáng)葛屬植物-根瘤菌共生固氮效率的定量研究以及影響葛屬植物-根瘤菌共生固氮效率的環(huán)境因素的研究，以期為充分發(fā)揮葛屬植物-根瘤菌共生體的固氮作用提供理論依據(jù)和科學(xué)參考。

4 葛屬植物-根瘤菌共生體的生態(tài)適應(yīng)性及應(yīng)用

大量研究表明，與同一豆科植物共生的根瘤菌在不同生態(tài)環(huán)境下存在不同的優(yōu)勢(shì)菌種，且不同菌株在生物地理分布、共生匹配性和共生固氮效率方面存在差異，這都是根瘤菌長(zhǎng)期適應(yīng)性分化的結(jié)果[9,45-47]。根瘤菌能刺激宿主植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Induced systemic resistance）和誘導(dǎo)系統(tǒng)耐受性（Induced systemic tolerance）， 改 變 根 系 結(jié) 構(gòu)（Root system architecture）等，從而提高宿主植物對(duì)逆境脅迫的耐受性[48]。葛屬植物作為荒坡上常見(jiàn)的先鋒植物，其與根瘤菌形成的共生體能夠適應(yīng)多種生態(tài)環(huán)境。前期研究從野葛根瘤中分離出具有較強(qiáng)耐酸能力的根瘤菌，能夠在pH 值=4.6 的強(qiáng)酸環(huán)境中生長(zhǎng)，酸脅迫顯著降低葛藤根系活性和根毛變形率，接種根瘤菌后能顯著提高盆栽條件下植株生物量、根瘤鮮重以及植株全氮含量，也能提高根系土壤中微生物數(shù)量和土壤酶活 性[49-50]。這表明野葛根瘤菌能在一定程度上協(xié)助植物抵抗酸性脅迫，且能影響根際微生物群落，從而提高土壤肥力。另外，葛藤具有一定的富集重金屬Cu 的能力，能在鉛鋅礦廢渣場(chǎng)地上生長(zhǎng)，是一種適合重金屬尾礦和工業(yè)污染區(qū)的生態(tài)經(jīng)濟(jì)型建群植物[51-52]。目前，葛屬植物根瘤菌在緩解酸脅迫方面有較好的應(yīng)用效果，今后可進(jìn)一步開(kāi)展葛藤根瘤菌對(duì)其他逆境脅迫（如重金屬脅迫）的響應(yīng)及適應(yīng)機(jī)制的研究。

根際微生物群落在根瘤菌與宿主互作和共生關(guān)系形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[53-54]。已有的研究表明，根瘤菌與其他根際細(xì)菌存在明顯互作關(guān)系，假單胞菌和芽孢桿菌等大豆根際微生物與根瘤中快生、慢生根瘤菌的定殖密切相關(guān)[55-57]。因此，在篩選和應(yīng)用葛屬植物根瘤菌資源時(shí)，應(yīng)充分考慮土著根瘤菌及根際微生物群落與接種根瘤菌之間的相互作用。

5 展 望

目前，學(xué)者們對(duì)大豆及其他栽培豆科作物的根瘤菌開(kāi)展了大量的研究和應(yīng)用，但對(duì)與野生豆科植物共生的根瘤菌的研究相對(duì)較少，關(guān)于根瘤菌耐逆境脅迫的分子遺傳機(jī)制知之甚少。葛屬植物作為廣泛分布于我國(guó)各地的藤本植物，蘊(yùn)藏著豐富的根瘤菌資源，加強(qiáng)對(duì)葛屬根瘤菌的研究，對(duì)于豐富我國(guó)根瘤菌種質(zhì)資源庫(kù)、開(kāi)發(fā)根瘤菌菌劑應(yīng)用于栽培葛的種植和生產(chǎn)中具有重要意義。基于現(xiàn)有的研究，提出以下展望。

（1）系統(tǒng)開(kāi)展葛屬植物根瘤菌資源的調(diào)查及分類地位的研究，收集、篩選和保藏一批與葛屬植物共生的根瘤菌資源，尤其應(yīng)加強(qiáng)栽培葛主產(chǎn)區(qū)根瘤菌資源的篩選。在此基礎(chǔ)上，加強(qiáng)不同生態(tài)區(qū)（地理環(huán)境、土壤類型等因素）葛屬植物-根瘤菌遺傳多樣性以及共生固氮效率的比較研究，明確影響葛屬植物-根瘤菌共生體固氮效率的主要因素，揭示葛屬植物-根瘤菌共生體的生物地理學(xué)分布格局及形成機(jī)制。

（2）加強(qiáng)葛屬植物-根瘤菌的共生特異性及其與土著根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)作用的研究，并開(kāi)展葛屬植物-根瘤菌共生體對(duì)多種逆境的響應(yīng)機(jī)制和分子遺傳機(jī)制的研究。在此基礎(chǔ)上，采用生物技術(shù)手段改造或構(gòu)建優(yōu)良根瘤菌菌株，開(kāi)發(fā)根瘤菌生物肥料應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。