生物催化C—C成鍵反應(yīng)及其應(yīng)用

齊娜，宋偉，劉立明，吳靜

（1 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122； 2 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

引 言

C—C成鍵反應(yīng)是有機(jī)合成中的關(guān)鍵反應(yīng)，一般是在有機(jī)催化劑、金屬或酸堿催化劑的作用下進(jìn)行[1-2]，但面臨著催化劑難以回收、消耗量大且對(duì)環(huán)境有害等難題。生物催化劑因具有高選擇性、反應(yīng)條件溫和及可再生等優(yōu)點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于制藥、化學(xué)合成和食品等工業(yè)領(lǐng)域。近年來(lái)，利用酶催化C—C 成鍵反應(yīng)而生成精細(xì)化學(xué)品的研究越來(lái)越廣泛（表1），如漆酶催化氧化C—C 偶聯(lián)反應(yīng)生成咔唑、苯并呋喃等化學(xué)品[3-4]，角鯊烯環(huán)化酶催化C—C閉環(huán)反應(yīng)獲得用于香料生產(chǎn)的霍烯、萜類等化合物[5-6]，依賴Pd 的金屬酶Suzukiase 催化合成多烯烴、苯乙烯和聯(lián)苯的衍生物[7]（應(yīng)用于天然產(chǎn)物、有機(jī)材料的生物合成中），醛縮酶催化Aldol 反應(yīng)生成多羥基化合物是合成碳水化合物和其他天然產(chǎn)物的基石[8]，依賴ThDP 酶催化的Acyloin condensation 反應(yīng)合成α-羥基酮，廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工和制藥行業(yè)[9]，異胡豆苷合酶（STR）和去甲烏藥堿合酶（NCS）催化Pictet-Spengler 反應(yīng)生成的生物堿具有多種藥理活性[11]。本文主要介紹了近年來(lái)研究最為廣泛的酶催化 Aldol、Acyloin condensation、Stetter、Pictet-Spengler 形成C—C 鍵的反應(yīng)，以及這些反應(yīng)在合成精細(xì)化學(xué)品中的應(yīng)用前景[12-13]。

表1 生物催化C—C成鍵反應(yīng)及其在合成精細(xì)化學(xué)品中的應(yīng)用Table 1 Biocatalytic C—C bond formation reaction and fine chemicals generated at the C—C bond site

1 不對(duì)稱羥醛縮合反應(yīng)

不對(duì)稱羥醛縮合反應(yīng)（Aldol 反應(yīng)）是指具有α氫原子的醛或酮在一定條件下形成烯醇負(fù)離子，再與另外一分子羰基化合物發(fā)生加成反應(yīng)，從而形成β-羥基羰基化合物的一類生成C—C 鍵的有機(jī)反應(yīng)[14]。該反應(yīng)主要由醛縮酶催化，根據(jù)羰基活化的方式不同，機(jī)制可分為：I 型醛縮酶通過(guò)形成一個(gè)希夫堿中間體來(lái)激活羰基供體；Ⅱ型醛縮酶含有輔因子Zn2+，通過(guò)與供體中的羰基和α 羥基形成螯合物，進(jìn)而生成Aldol 產(chǎn)物。醛縮酶能接受磷酸二羥丙酮（DHAP）、二羥基丙酮（DHA）、丙酮酸、乙醛以及甘氨酸等作為供體底物[12]。但目前工業(yè)上應(yīng)用最多的是依賴DHAP、DHA和甘氨酸的醛縮酶，可合成稀有或非天然的單糖[15-16]和β-羥基-α-氨基[17]。

依賴磷酸二羥丙酮的醛縮酶：到目前為止，已鑒定出4 種依賴DHAP 的醛縮酶[15]，分別為果糖-1,6-二磷酸醛縮酶（FruA，EC 4.1.2.3）、巖藻糖-1-磷酸醛縮酶（FucA，EC 4.1.2.1）、塔格糖-1,6-二磷酸醛縮酶（TagA，EC 4.1.2.40）和鼠李糖-1-磷酸醛縮酶（RhaD，EC 4.1.2.19）。其中應(yīng)用最廣泛的是從兔肌肉中分離的I 型醛縮酶FruA，Iturrate 等[18]通過(guò)基因融合技術(shù)成功地將FruA 應(yīng)用于催化立體選擇性C—C 成鍵，反應(yīng)速率比游離的酶提高了20 倍。巖藻糖-1-磷酸醛縮酶（FucA）和鼠李糖-1-磷酸醛縮酶（RhaD）屬于Ⅱ型醛縮酶，能接受廣泛醛類作為底物，并應(yīng)用于制備稀有糖[19]（表2），其中FucA 在二甲基甲酰胺(DMF)/H2O(1∶4，體積比)混合物中，催化效率提高2～3 倍，所產(chǎn)生的N-氨基多醇可以通過(guò)還原胺化進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為亞胺基[20]。但依賴于DHAP 醛縮酶主要缺點(diǎn)是對(duì)DHAP 嚴(yán)格的底物特異性，Sugiyama 等[21]報(bào)道了一個(gè)體內(nèi)選擇系統(tǒng)，用于定向進(jìn)化L-鼠李糖-1-磷酸醛縮酶（RhaD），以改變其底物特異性，即從DAP 到二羥基丙酮（DHA）。Sanchez-Moreno 等[22]建立了一個(gè)由來(lái)源于大腸桿菌的巖藻糖-1-磷酸醛縮酶（FucA）、來(lái)源Citrobacter freundii 的DHA 激酶、雙羥基丙酮激酶（DHAK）等組成的多酶體系，催化廉價(jià)的二羥基丙酮（DHA）和ATP，生成相應(yīng)的酮糖-1-磷酸。

依賴二羥基丙酮的醛縮酶：果糖-6-磷酸醛縮酶（FSA，EC 4.1.2.17）依賴DHA 作為供體底物[23]，同時(shí)還可接受如羥基丙酮（HA）、羥基丁酮（HB）、乙醇醛（GO）等非磷酸供體底物[24-25]。為了提高野生型FSA 對(duì)較強(qiáng)親核結(jié)構(gòu)底物的耐受性，Gueclue 等[26]通過(guò)對(duì)FSA 活性口袋與底物結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行分析和改造，發(fā)現(xiàn)突變體FSA-L107/L163A 能接受線性/支鏈、C3～C7 1-羥基烷-2-酮及幾種DHA 衍生醚作為供體底物。以D6、T26和N28為靶標(biāo)，建立了一個(gè)突變庫(kù)，發(fā)現(xiàn)D6殘基是使非羥化親核試劑具有活性的關(guān)鍵殘基，其中突變體D6X 和D6X/T26X 對(duì)酮和醛有不同的偏好性[17]。突變體FSA-D6H 能接受乙醇、丙酮、丁酮和環(huán)戊酮等脂肪族親核試劑為底物，合成新的Aldol 產(chǎn)品[27]；突變體FSA-D6Q 催化合成3-羥基-2-甲基丙醛產(chǎn)量能達(dá)到72 g·L-1，收率88.5%[28]。最近Yang 等[29]通過(guò)對(duì)FSA 亞基內(nèi)與亞基間相互作用的綜合調(diào)控，發(fā)現(xiàn)突變體I31T/Q59T/I195Q 能以硫、碳、氧相關(guān)的雜芳醛作為底物，且活性提高了27～278 倍。進(jìn)一步通過(guò)X 射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)和分子動(dòng)力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)該突變體能夠顯著地改變亞基之間界面區(qū)域的靈活性、擴(kuò)大底物結(jié)合口袋和增強(qiáng)質(zhì)子轉(zhuǎn)移。此外，F(xiàn)SA 突變體還廣泛應(yīng)用于制備醛糖衍生物，如Schmidt 等[30]發(fā)現(xiàn)雙突變體（FSA-A129T/S166G 和FSA-A129T/A165G）和一個(gè)三突變體（FSA-A129T/A165G/S166G）可制備幾種脫氧和O 取代的D-己糖。突變體FSA-A129S 根據(jù)供體（DHA 或HA）的不同，可催化硝基丁醛等醛類化合物，生成新的硝基環(huán)醇[31]（圖1）。

依賴甘氨酸的醛縮酶：依賴甘氨酸作為供體底物的醛縮酶包括[32-33]：絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT，EC 2.1.2.1）、L 或D 特異性蘇氨酸醛縮酶（LTA，EC 4.1.2.5 和DTA，EC 4.1.2.42）。來(lái)自Arthrobacter sp 的D-蘇氨酸醛縮酶（DTA）[34]和L-蘇氨酸醛縮酶（LTA）[35]除了能接受廣泛醛類作為受體[33]，還可接受甘氨酸以外的氨基酸供體，如丙氨酸、絲氨酸和半胱氨酸，因此其應(yīng)用范圍也擴(kuò)大到不對(duì)稱合成α,α-二取代的β-羥基-α-氨基酸和β-氨基醇。進(jìn)一步通過(guò)同源序列搜索發(fā)現(xiàn)了5種接受丙氨酸和絲氨酸作為氨基酸供體的新型蘇氨酸醛縮酶[36]，將這5 種酶過(guò)量表達(dá)于大腸桿菌中，能合成4 種β-羥基-Lα-氨基酸和β-羥基-D-α-氨基酸，且均在α-C 上具有高對(duì)映選擇性（ee＞99%）（圖2）。最近Gong 等[37]利用2,4-二硝基苯肼（DNPH）靈敏度高且對(duì)底物干擾小的特點(diǎn)，建立了一種快速、可靠測(cè)定蘇氨酸醛縮酶對(duì)醛和甘氨酸縮合活性的方法，可用于高通量篩選和表征TAs。利用這一方法鑒定出兩個(gè)突變體D321C 和N101G，轉(zhuǎn)化率比野生型菌株分別提高了13.9%和10.4%。來(lái)源于Streptococcus thermophilus的依賴于PLP 醛縮酶L-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMTsth）[38]對(duì)甘氨酸的羥醛縮合反應(yīng)具有良好的立體選擇性。在對(duì)該酶的結(jié)構(gòu)、催化相關(guān)的活性位點(diǎn)殘基以及催化機(jī)理研究的基礎(chǔ)上[39]進(jìn)行定向突變，發(fā)現(xiàn)突變體Y55T 可將D-Ser 加成到各種醛類中，從而高效、高對(duì)映和非對(duì)映選擇性合成α,α-二取代β-羥基-α-氨基酸[40]（圖2）。

表2 依賴DHAP醛縮酶綠色合成稀有糖及其衍生物Table 2 Green synthesis of rare sugars and their derivatives by DHAP aldolase

2 酮醇縮合反應(yīng)

圖1 FSA催化C—C鍵形成多羥基化合物Fig.1 FSA catalyzes C—C bonds to form polyhydroxy compounds

酮醇縮合反應(yīng)（Acyloin condensation）是C—C成鍵的常見(jiàn)反應(yīng)，由ThDP 依賴的酶如環(huán)己烷-1,2-二酮水解酶（CDH）、苯甲醛裂解酶（BAL）、黃素酶（YerE）、乙酰丙酮合成酶（AAS）和羥基丙酮∶二氯苯酚氧化還原酶（AO∶DCPIP OR）所催化。催化過(guò)程中的關(guān)鍵步驟是底物與輔因子ThDP 的噻唑環(huán)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生活性的中間體“活化的醛”，進(jìn)而生成α-羥基酮[41]。

環(huán)己烷-1,2-二酮水解酶（CDH，EC 3.7.1.11）：CDH 催化丙酮酸和一系列芳香受體醛的酮醇縮合反應(yīng)，從而將苯甲醛衍生物轉(zhuǎn)化為高度對(duì)映體富集的（R）-PAC[42-43]。在2014 年，Loschonsky 等[44]發(fā)現(xiàn)CDH 能轉(zhuǎn)化羥基苯甲醛、硝基苯醛和萘醛，生成仲-α-羥基酮具有＞99%轉(zhuǎn)化率和92%～99% ee 值。隨后在半制備規(guī)模上，將4-（叔丁基）苯甲醛和2-萘醛以較高的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的α-羥基酮產(chǎn)品（圖3）。對(duì)CDH 進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造獲得突變體H28A/N484A 能夠在丙酮酸和環(huán)己烷-2,3-二酮之間形成C—C 鍵，生成環(huán)叔-α-羥基酮（ee 值高達(dá)88%），且該突變體除了接受丙酮酸作為底物，還可接受2,3-丁酮為底物，但活性較弱[45]。隨后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CDH 可通過(guò)3 種途徑：丙酮酸、乙醛或丙酮酸與乙醛的酮醇縮合反應(yīng)來(lái)催化形成（S）-乙酰丙酮，對(duì)映選擇性高達(dá)95%ee[46]。

苯 甲 醛 裂 解 酶（BAL，EC 6.2.1.7）：來(lái) 源 于Pseudomonas fluorescens的BAL能將芳香醛轉(zhuǎn)化為手性α-羥基酮[47-48]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)以苯甲醛作為供體，（±）-2-甲基丙醛、（±）-2-甲基丁醛和（±）-2-甲基戊醛作為受體底物，可合成具有良好對(duì)映選擇性的仲-α-羥基酮產(chǎn)物，且非對(duì)映選擇性隨著受體醛化合物的鏈長(zhǎng)增加而增加[49]（圖3）。然而，在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，利用來(lái)源于Hansenula sp 的氧化酶和過(guò)氧化氫酶將脂肪族醇制備成相應(yīng)的醛，BAL 可以短鏈脂肪族醇（甲醇到丁醇）作為底物催化合成C—C 鍵，生成光學(xué)純的2-羥基丙酚和類似物（ee 值為98%～99%）[50]。

圖2 蘇氨酸醛縮酶催化形成的β-羥基-α-氨基化合物Fig.2 Synthesis of β-hydroxy-α-amino compounds catalyzed by threonine aldolase

圖3 ThDP依賴的酶催化酮醇縮合反應(yīng)合成仲-α-羥基酮化合物Fig.3 ThDP-dependent enzymes catalyze the ketol condensation reaction to form secondary-α-hydroxyketone

黃素酶（YerE，EC 3.5.99.1）：來(lái)源于Pseudomonas protegens的YerE能以環(huán)酮、開(kāi)環(huán)酮、1,2-二酮、α-酮和β-酮酯作為受體底物合成叔-α-羥基酮[51]（圖4）。隨后利用振動(dòng)圓二色譜（VCD）對(duì)YerE的立體選擇性進(jìn)行研究[52]，發(fā)現(xiàn)該酶可將（R）-3-甲基環(huán)己酮轉(zhuǎn)化為（R,R）構(gòu)型的叔醇，相應(yīng)的（S）構(gòu)型轉(zhuǎn)化為（S,S）結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物（圖4）。為了進(jìn)一步擴(kuò)寬該酶的底物范圍，Hampel等[53]研究了來(lái)源于Pseudomonas protegens分辨率為1.55 ?（1?=0.1 nm）的YerE 晶體結(jié)構(gòu)，并與來(lái)源于Yersinia pseudotuberculosis 的YerE進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)兩種YerE在其活性位點(diǎn)具有相同的氨基酸殘基，并具有非常相似的底物范圍和催化活性，可將苯甲醛及其衍生物和酮轉(zhuǎn)化為2-羥基酮。根據(jù)獲得的晶體結(jié)構(gòu)，對(duì)YerE的三維結(jié)構(gòu)以及活性位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)潛在的反平行底物結(jié)合口袋（S口袋）被氨基酸側(cè)鏈阻斷，而通過(guò)V479A的突變可使產(chǎn)物羥基戊酮和羥庚醇的S對(duì)映體分別提高到57%ee和31%ee。

乙酰丙酮合成酶（AAS）/羥基丙酮∶二氯苯酚氧化 還 原 酶（AO∶DCPIP OR）：來(lái) 源 于Bacillus stearothermophilus 的AAS 可催化二烷基或烷基芳基-1,2-二酮的縮合反應(yīng)生成叔-α-羥基酮，產(chǎn)率達(dá)到62%，ee 值為91%[54]。研究表明，AAS 是一種誘導(dǎo)酶，需要低濃度糖和高濃度乙酰丙酮才能表達(dá)[55]。將AAS 和依賴于NADH 的乙酰丙酮還原酶（AAR）進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)，獲得中間產(chǎn)物α-烷基-α-羥基-β-二酮的產(chǎn)率是30%～60%，ee 值為67%～90%，隨后將其還原為ee ＞95%的α-烷基-α-羥基-β-二羥基酮化合物，相應(yīng)的產(chǎn)率是60%～70%[56]。將這兩種酶結(jié)合使用還可以合成手性綠茶香料化合物3-羥基-3-甲 基 壬 烷-2, 4- 二 酮（ee ＞95%）[52]。 2015 年Bernacchia課題組[57]發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Bacillus licheniformis的AO:DCPIP OR 與AAS 催化的酮醇縮合反應(yīng)在產(chǎn)物組成和對(duì)映體選擇性方面表現(xiàn)出顯著的相似性，這表明它們可能是同一種酶。在E.coli中過(guò)量表達(dá)AO:DCPIP OR，將甲基乙酰丙酮作為乙酰負(fù)離子供體，與一系列酮結(jié)合使用，可生成與其他ThDP 依賴酶相反的立體化學(xué)所需的叔醇[58]。此外，該酶還能催化芳香反應(yīng)物和混合芳香或脂肪的苯甲酰縮合反應(yīng)，將4-羥基-4-甲基己烷-3-酮用作活化丙酮的前體，甲基乙酰丙酮作為活化的乙醛供體生成叔醇[59]（圖5）。

酶催化酮醇縮合反應(yīng)在C—C 鍵形成位點(diǎn)生成的α-羥基酮是一種普遍存在的結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于抗真菌藥（醋酸地塞米松）、抗腫瘤抗生素（Olivomycin A）或法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（治療丁型肝炎）或淀粉-β-蛋白（治療阿爾茨海默氏病）。α-羥基酮的高效合成一直都是醫(yī)藥工業(yè)的重要研究熱點(diǎn)。

圖4 YerE催化C—C鍵的形成用于制備叔-α-羥基酮Fig.4 YerE catalyzes the formation of C—C bonds for the preparation of tertiary-α-hydroxy ketones

圖5 AO:DCPIP使用2,3-丁二酮作為乙酰陰離子供體催化生成叔醇Fig.5 AO:DCPIP uses 2,3-butanedione as an acetyl anion donor to catalyze the formation of tertiary alcohols

3 Stetter 反 應(yīng) 催 化C—C 成 鍵 形 成1，4-二羰基化合物

Stetter 反應(yīng)是指能被ThDP 依賴性酶催化α,β-不飽和酮進(jìn)行的1,4-加成反應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)的1,4-二羰基化合物[13]，該反應(yīng)是氰基負(fù)離子或噻唑負(fù)離子對(duì)羰基進(jìn)行加成，使親電性的羰基碳轉(zhuǎn)化為親核性，隨后進(jìn)攻α,β-不飽和酮得到1,4-二酮、γ-酮酸等化合物[60]。能催化Stetter 反應(yīng)的酶主要有：PigD酶和MenD酶。

碳連接酶（PigD，EC 2.2.1.5）：來(lái)源于Serratia marcescens 的PigD 酶是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可進(jìn)行1,4-加成反應(yīng)的酶[61]，能以酮為底物代替1,2-加成反應(yīng)中的受體醛，通過(guò)降低羰基活性，得到1,4-加成反應(yīng)的產(chǎn)物[62]。隨后，基于PigD 酶的氨基酸序列進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Saccharopolyspora erythraea 的SeAAS和Hahella chejuensis的HapD 也可進(jìn)行1,4-加成反應(yīng)，且具有較高的對(duì)映體選擇性，但缺點(diǎn)是這兩個(gè)酶的可溶性表達(dá)有待進(jìn)一步提高[63]。隨后Kasparyan 等[64]在大腸桿菌中對(duì)這兩種酶進(jìn)行了異源表達(dá)，在基因GroEL/ES 的共同表達(dá)下可提高可溶性蛋白量。

圖6 ThDP依賴的酶催化α,β-不飽和酮生成1,4-二羰基化合物Fig.6 ThDP-dependent enzymes catalyze α,β-unsaturated ketones to produce 1,4-dicarbonyl compounds

2-琥珀酰基-5-烯醇丙酮基-6-羥基-3-環(huán)己烯-1-羧酸合酶（MenD）：來(lái)自大腸桿菌的MenD 能在其天然底物異硬脂酸酯中進(jìn)行酯型α-酮戊二酸酯（α-KG）的加成反應(yīng)[65]，這是首次觀察到利用β-取代的α,β-不飽和酸的1,4-加成反應(yīng)，然而這個(gè)反應(yīng)僅限于底物為（2S,3R）-2,3-二羥基-2,3-二氫苯甲酸酯及其羧甲基醚衍生物。隨后利用MenD 酶催化各種芳族醛的1,2-加成反應(yīng)，從而獲得了δ-羥基-γ-酮酸。此研究表明MenD 對(duì)α-酮戊二酸底物具有較高的特異性，但是在1,2-加成反應(yīng)中醛受體底物的范圍則較廣泛[10]。在對(duì)MenD 酶的底物譜分析表明，該酶確實(shí)可催化Stetter-型反應(yīng)，能將α-KG、丙烯酸酯和丙烯腈轉(zhuǎn)化為γ-酮酸，且具有較高的轉(zhuǎn)化率（71%～99%）[63]（圖6）。而在醛縮酶和依賴于ThDP 的酶結(jié)合使用的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)丙酮酸依賴的醛縮酶（2-氧-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖苷酶EDA）生成的（S）-HOG 可以作為MenD 的底物，可與2,3-反式CHD、1,2-芳香醛和脂肪醛發(fā)生Stetter 加成反應(yīng)，這為生成1,4-二羰基的化合物提供了一種新的方法[66]。

通過(guò)上述兩種酶催化Stetter 反應(yīng)形成的1,4-二酮、γ-酮酸化合物在天然產(chǎn)物、藥物和新型材料合成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但由于該酶的底物范圍狹窄、穩(wěn)定性差，使得利用Stetter反應(yīng)的可持續(xù)生產(chǎn)路線的開(kāi)發(fā)成為了制藥和精細(xì)化工行業(yè)的重大挑戰(zhàn)。

4 Pictet-Spengler反應(yīng)

Pictet-Spengler 反應(yīng)是獲得重要藥物骨架β-咔啉和四氫異喹啉的重要途徑，包括兩個(gè)步驟：第一步是在酸催化的條件下形成亞胺中間體；第二步是發(fā)生Mannich 型親電芳香族取代反應(yīng)，進(jìn)而生成β-咔啉和四氫異喹啉產(chǎn)物[67-68]。β-咔啉骨架具有很強(qiáng)生物活性的吲哚生物堿，是苯二氮卓類藥物受體眾多激動(dòng)劑和反激動(dòng)劑的組成部分，廣泛應(yīng)用于治療抑郁癥和焦慮癥[69]；四氫異喹啉是治療哮喘的β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，同時(shí)還具有抗血小板和抗血栓形成的活性[70]。催化Pictet-Spengler 反應(yīng)的酶主要有異胡豆苷合酶（STR）、McbB 酶和去甲烏藥堿合酶（NCS）。

異胡豆苷合酶（STR，EC 4.3.3.2）：最早鑒定出催化Pictet-Spengler 反應(yīng)的酶是來(lái)源于Rauvolfia serpentina 的異胡豆苷合酶（STR）[71]，該酶催化天然底物色胺和醛類化合物縮合形成（S）-異胡豆苷[圖7(a)]。該酶除了以段馬錢子苷衍生物作為醛底物，還可以各種取代的色氨酸衍生物為底物。然而，最近發(fā)現(xiàn)來(lái)自O(shè)phiorrhiza pumila 的STR 可以接受非手性短鏈的醛作為底物，產(chǎn)生與天然底物段馬錢子苷相反的（R）-構(gòu)型的產(chǎn)物，但活性較低[圖7(b)][72]。其反向結(jié)合導(dǎo)致立體化學(xué)偏好性轉(zhuǎn)換的根源在于底物位置的轉(zhuǎn)換，同一酶對(duì)一種底物可具有兩種不同結(jié)合模式，最終導(dǎo)致產(chǎn)物相反的絕對(duì)構(gòu)型[73]。而在2016 年Fischereder 等[74]利用來(lái)源于Arthrobacter sp和Silibacter pomeroyi 的ω-轉(zhuǎn)氨酶同時(shí)進(jìn)行酮的胺化和色氨酸與斷馬錢子苷的縮合反應(yīng)，在四氫-β-咔啉中心C3 處形成具有另外一個(gè)立體異構(gòu)中心的（R）-異胡豆苷衍生物（產(chǎn)率高達(dá)98%，ee 值為98%。）。隨后通過(guò)建立六葉螺旋槳蛋白環(huán)狀排列的突變體庫(kù)，對(duì)來(lái)源于Rauvolfia serpentina STR 活性位點(diǎn)的兩個(gè)區(qū)域氨基酸殘基進(jìn)行分析和改造，發(fā)現(xiàn)該酶在不損失其整體結(jié)構(gòu)的情況下，產(chǎn)生的幾個(gè)活性突變體（H307A、D273A 和E309G）對(duì)天然底物具有較高活性[75]。

圖7 異胡豆苷合酶催化的Pictet-Spengler反應(yīng)Fig.7 Pictet-Spengler reaction catalyzed by strictosidine synthase

McbB酶：來(lái)源于Marinactinospora thermotolerans的McbB 酶能催化L-色氨酸和草酰乙醛的Pictet-Spengler反應(yīng)[76]，再經(jīng)過(guò)氧化和脫羧得到β-咔啉結(jié)構(gòu)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)該酶還能以5-甲基-D/L-色氨酸、7-甲基-D/L-色氨酸及其短鏈的脂肪醛作為底物。

去甲烏藥堿合酶（NCS，EC 4.2.1.78）：NCS 通過(guò)建立新C—C 鍵催化生成芐基四氫異喹啉生物堿中間體[77-78]，2010 年，Bonamore 等[79]以廉價(jià)的酪氨酸和多巴胺作為底物，在一鍋兩步的反應(yīng)中，獲得高產(chǎn)率和高純度的對(duì)映異構(gòu)體（S）-去甲氯氨酸。隨后通過(guò)NCS 與轉(zhuǎn)氨酶結(jié)合，采用級(jí)聯(lián)反應(yīng)的方式獲得了高純度的（S）-芐基異喹啉生物堿[80]。對(duì)酶底物譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Thalictrum flavum（TfNCS）和Coptis japonica（CjNCS2）的NCS 能轉(zhuǎn)化苯乙醛衍生物，其中CjNCS2 能以線性脂肪族醛以及α-取代的烷基為底物，TfNCS 則能以萘-1-基乙醛等為底物[81]。盡管NCS 對(duì)各種醛類底物具有廣泛的耐受性，但最新研究表明，未活化的酮也可作為NCS 的底物，如Lichman 等[82]發(fā)現(xiàn)TfNCS 能以4-羥基苯丙酮為底物合成1,1′- THIQ，而通過(guò)對(duì)NCS 的作用機(jī)理以及與天然醛底物的對(duì)接研究，發(fā)現(xiàn)突變體M97F/L/V通過(guò)擴(kuò)大酶與底物的結(jié)合口袋，接受苯丙酮、環(huán)己酮和4-甲基取代的環(huán)己酮作為底物。而突變體L76A/V、A79F/I 則通過(guò)增加體積較大的疏水底物（4-叔丁基和4-苯基取代的環(huán)己酮）與酶的親和力，進(jìn)而合成相應(yīng)的產(chǎn)物，其中突變體A79F/I 對(duì)酮底物親和性最大，相應(yīng)的產(chǎn)物1,1′-雙取代的THIQ 產(chǎn)率能達(dá)到74%～99%（圖8）。

總而言之，Pictete-Spenglerases 是有價(jià)值的生物催化劑，可以在溫和的反應(yīng)條件下以立體選擇性和區(qū)域選擇性的方式進(jìn)行C—C 成鍵反應(yīng)。但目前只有上述兩種酶STR 和NCS 被廣泛地應(yīng)用于合成β-咔啉和四氫異喹啉等生物堿，McbB 酶因分離方法困難和酶穩(wěn)定性差而限制了實(shí)際應(yīng)用。因此，擴(kuò)大Pictete-Spenglerases 的范圍以及提高酶的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中的熱點(diǎn)問(wèn)題。

5 總結(jié)與展望

圖8 NCS-Tf突變體催化合成1,1′-雙取代的THIQFig.8 NCS-Tf mutant catalyzed synthesis of 1,1′-disubstituted THIQ

近年來(lái)，生物催化C—C 成鍵反應(yīng)在有機(jī)合成中取得了巨大的進(jìn)步[83]，除了本綜述介紹的研究最為廣泛的醛縮酶催化的不對(duì)稱羥醛縮合反應(yīng)、CDH和YerE 等催化的酮醇縮合反應(yīng)、PigD 和Mend 催化的Stetter 反應(yīng)以及STR 和NCS 催化的Pictet-Spengler 反應(yīng)的研究外，一些具有潛在應(yīng)用價(jià)值的酶也逐漸被發(fā)現(xiàn)，如漆酶催化的氧化C—C 偶聯(lián)反應(yīng)、角鯊烯環(huán)化酶催化的C—C 閉環(huán)反應(yīng)和金屬酶Suzukiase 催化的Suzuki-Miyaura 反應(yīng)，這些反應(yīng)會(huì)在C—C 鍵位點(diǎn)形成咔唑、苯并呋喃、霍烯、苯乙烯和聯(lián)苯的衍生物等精細(xì)化學(xué)品。但是，目前大多數(shù)催化C—C 成鍵反應(yīng)的研究?jī)H限于擴(kuò)大酶的底物范圍以及提高酶的立體選擇性，還無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。因此，為了擴(kuò)大其作為工業(yè)產(chǎn)品的潛力，今后的研究應(yīng)該集中在提高酶的催化效率、反應(yīng)的設(shè)計(jì)和工藝優(yōu)化等方面，為此，需要從酶結(jié)構(gòu)、酶活性位點(diǎn)以及催化機(jī)理入手，通過(guò)蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化來(lái)提高酶的催化效率、立體選擇性以及對(duì)催化環(huán)境的耐受性。此外，還可從分子水平來(lái)提高酶的利用率減少催化劑的用量，如優(yōu)化拷貝數(shù)、載體以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）。采用一種綠色、經(jīng)濟(jì)以及實(shí)用的反應(yīng)路線是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)必不可少的一步，可以采用級(jí)聯(lián)反應(yīng)避免試劑昂貴、多步制備路線等缺點(diǎn)，通過(guò)對(duì)生物轉(zhuǎn)化的設(shè)計(jì)，從工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)更多的精細(xì)化學(xué)品。